怎样根据蛋白分子量配分离胶和浓缩胶浓度？

先明确基础逻辑：浓缩胶作用是把样品蛋白压成很窄一条样品带，不用于分离；分离胶才是决定不同分子量蛋白分辨效果的核心，浓缩胶一般统一用 5%，绝大多数情况不需要改动浓缩胶浓度。
浓缩胶常规固定 5%，孔径偏大，所有待分离蛋白都可以在此层堆积浓缩。只有目标蛋白分子量特别小的时候，才会微调浓缩胶。

分离胶的孔径随丙烯酰胺总浓度升高而变小。胶浓度越高，孔径越小，适合分离小分子蛋白；胶浓度越低，孔径越大，适合大分子蛋白。

蛋白分子量范围和分离胶选择。
4‑20 kDa 小分子蛋白，选用 15% 分离胶。这一段是小分子量，需要小孔径胶。要注意 4‑10 kDa 极小分子，普通 Tris‑甘氨酸体系容易跑出去，必要的时候更换 Tris‑Tricine 胶。
15‑40 kDa，选用 12% 分离胶，属于 WB 最常用浓度，适合大多数中等偏小蛋白。
30‑70 kDa，选用 10% 分离胶，通用性很强，很多细胞总蛋白样本优先这个浓度。
50‑120 kDa，选用 8% 分离胶，偏向中大分子量蛋白。
100‑200 kDa，选用 6%‑7.5% 分离胶，大蛋白需要更大孔径，迁移速率才可以拉开差距。
大于 200 kDa 超大蛋白，优先 4‑5% 分离胶。低浓度胶质地偏软，灌胶之后要小心操作，容易碎裂。

如果你的样本蛋白分子量分布跨度很宽，同时有大蛋白和小蛋白，单一浓度胶很难兼顾两端。这时可以选择梯度胶，例如 4‑12%、8‑16% 梯度胶。梯度胶孔径连续变化，可以同时分辨大小差异悬殊的蛋白；缺点是自制梯度胶操作更麻烦。

实操当中的几个关键点。
，目标蛋白尽量落在整块胶中间偏下的区域，不要靠近胶的最底部，防止跑出去；也不要停留在分离胶最上端，条带容易弥散。上样结束后观察溴酚蓝，溴酚蓝指示剂的迁移位置只能作为粗略参考，溴酚蓝本身分子量很小，不能代表蛋白位置。
第二，浓缩胶一般保持 5% 不变。只有分离极低分子量蛋白的时候，可以适当调高浓缩胶到 6%；大蛋白实验浓缩胶依旧维持 5% 即可，不要随意降低浓缩胶浓度，堆积效果会变差。
第三，低浓度分离胶（6% 及以下）凝胶质地软，取胶、转膜的时候动作轻柔，防止撕裂；高浓度 15% 以上胶偏脆，也容易碎。
第四，大分子量蛋白除了胶浓度，还需要降低电泳电压，减慢电泳速度，让大分子有充分时间在胶内迁移；小分子蛋白不要电泳时间过长，避免穿出分离胶。

补充一个常见误区，不是胶浓度越高分离效果就越好。如果大分子蛋白用很高浓度的分离胶，孔径太小，蛋白几乎无法迁移，条带滞留在分离胶顶部，严重弥散；小分子蛋白用过低浓度胶，直接跑出胶外丢失信号。优先依据目标蛋白分子量选定分离胶浓度，如果样本有多条目的蛋白，优先以主要关注的目标分子量作为选择依据，次要蛋白允许适当牺牲分离效果。

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