如何判断内参条带信号是否正常？

内参用来评估泳道上样、转膜、膜局部孵育是否出现故障，内参正常不等于目的蛋白结果就可信；但内参异常，这一个泳道的目的蛋白数据直接作废，不能用于结果分析。判读从条带亮度、形态、泳道之间均衡性、异常假象几个方面来看。

合格的内参条带特征

，条带位置符合该内参理论分子量。β‑actin 大约 42 kDa，GAPDH 大约 36 kDa，Tubulin‑β 大约 50 kDa，不要出现分子量明显偏移。
第二，条带边缘清晰锐利，没有明显空心，没有严重拖尾，没有弥散云雾状。条带是紧实的单一条带，一般不出现多条杂带。
第三，同一块胶各个泳道的内参信号亮度整体比较接近。上样量接近的样本，泳道之间内参强弱不会相差悬殊。允许存在小幅的强弱差异，属于正常上样误差；但不能出现某一条泳道内参明显特别亮或者几乎看不见。
第四，条带周围背景干净，没有大片灰蒙蒙底色。

各类异常内参对应的问题解析

1、某一个泳道内参完全消失或者信号极弱

先回看丽春红染色结果。
如果丽春红显示该泳道总蛋白本身就很浅：属于上样失误，加样漏出、样品降解沉淀、样本反复冻融降解，这份样本失效。
如果丽春红总蛋白着色是正常的，唯独内参信号弱。大概率是该泳道局部转膜缺陷（气泡阻挡、局部转膜不足）；也可能孵育的时候膜局部接触不到抗体，存在气泡或者局部干膜。

只要单个泳道内参消失，该泳道目的蛋白结果直接舍弃，不做定量分析。

2、同一块膜泳道之间内参亮度差距非常大

如果上样时已经按 BCA 定量调平总蛋白，跑出来内参强弱差异却很大。
原因分为几类：蛋白定量存在误差；上样的时候部分样品飘出加样孔；电泳时样品扩散；转膜局部效率不一致；膜在孵育时摇晃不够，局部抗体耗竭。
这时不建议直接拿这个膜做灰度校正定量，应当重新跑胶上样。

3、内参条带拖尾、弥散，条带变宽呈云雾状

样本蛋白发生降解是首要原因，样本内蛋白酶水解蛋白；也可能蛋白上样过载。
降解之后的样本，靶蛋白同样很可能已经被切断，即使还能看见内参，整份样本的结果可信度下降。

4、内参条带中间发白空心

条带两边亮中间淡。几乎都是孵育阶段膜表面残留气泡，气泡隔绝抗体接触；少数是转膜时胶‑膜之间气泡。属于局部孵育假象，该泳道不能用于灰度分析。

5、内参出现多条带（上下多出杂带）

一部分是蛋白降解产物；还有部分内参抗体本身特异性一般，会识别同源蛋白。
这种情况不适合灰度定量；仅可以粗略看有无信号，不适合正式实验。

容易踩的认知误区

内参亮不等于目的蛋白一定没问题内参大多分子量偏小，小分子更容易转膜；大分子量目的蛋白依旧可能转膜残留于胶内。内参只验证小分子蛋白的整套流程，不能直接证明大分子靶蛋白转印、结合正常。

内参也会受实验处理诱导发生表达改变部分药物、造模处理条件下，GAPDH、β‑actin 本身表达会发生变化。这种情况下该内参就不再适合作为参照，需要更换另外一种管家蛋白。不能无条件默认内参永远恒定不变。

不要以内参信号去反向修正过曝的目的条带。如果目的条带已经曝光饱和，哪怕内参很漂亮，灰度定量也无效。

实操判读流程

先观察每一条泳道内参条带的形态是否锐利完整；再横向比较同一张膜各个泳道之间内参亮度是否大体均衡；结合丽春红回看总蛋白上样情况；同时确认该内参不会被你的实验处理调控。
只有形态完好、泳道之间信号相对均衡，并且该管家基因不受实验条件影响，这份内参才判定为正常，才可以用来校正目的蛋白的灰度值。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司