如何判断阳性对照样本的上样量是否足够？

阳性对照的目的是保证靶蛋白能够明显检出，它的上样量不建议跟待测样本完全对齐，可以适度偏高，但也不能过载。判断分为事前预估、电泳‑丽春红间接评估、显影结果反馈这三个层面。

事前预估（上样之前）

首先参考过往实验数据，如果这份阳性对照是实验室之前验证过的裂解样品，可以直接沿用上次成功出条带的上样质量。
普通细胞裂解液常用 20‑40 μg 总蛋白；动物组织裂解液一般 25‑50 μg 总蛋白。

注意这里是总蛋白含量（BCA 或者 Bradford 测定的结果），不是目标蛋白的绝对质量。阳性对照只是总蛋白里含有靶蛋白，靶蛋白占比未知。
重组蛋白阳性对照不一样，它是纯化抗原，可以直接按 ng 级别上样，一般几十‑几百 ng。

仅仅依靠 BCA 测出来的总蛋白浓度并不完全保险。蛋白定量会存在系统误差；另外样本经过反复冻融之后，总蛋白浓度读数没变，但靶蛋白已经发生降解，实际有效靶蛋白含量下降。所以定量只能作为上样前的参考依据，不能作为充足与否的最终判定。

电泳转膜之后：丽春红染色初步评估

转膜完成之后先做丽春红染色。观察阳性对照泳道的总蛋白着色。

泳道条带丰富，深浅和相邻泳道相比没有明显变淡，说明整体总蛋白上样量在液相转移环节没有大量丢失。

如果阳性对照泳道整体颜色很浅，就算 BCA 算出来上样微克数很高，也提示上样过程存在损失，比如上样时样品飘出加样孔，或者蛋白降解，实际有效上样偏低。

但是丽春红只能看全部总蛋白，依旧看不到其中目标靶蛋白，只能排除严重的上样失败，不能证明靶蛋白足够。

依靠内参条带间接判断

孵育完内参之后观察阳性对照泳道管家蛋白（β‑actin、GAPDH）的信号。

阳性对照泳道内参条带明亮清晰，和其他泳道亮度处于同一水平，代表该泳道总的蛋白上样量大体是充足的。

如果阳性对照泳道的内参明显弱于其他泳道，说明实际有效上样偏低，有可能上样的时候样品流失，或者蛋白降解。

⚠️ 重点局限：内参充足不等于目的靶蛋白足够。内参是管家蛋白；有可能阳性对照样本里面管家蛋白保存完好，唯独目的靶蛋白因为传代、取材、降解而丢失，内参依旧很亮，但靶蛋白信号消失。内参只能做间接佐证，不是最终证据。

一抗显影结果反馈，最直接的判断

显影后看阳性对照条带本身。

阳性对照条带信号清晰，没有饱和过曝，曝光时没有瞬间一片黑，条带边缘没有明显拖尾。代表上样量合适。

阳性对照条带信号很弱，但内参是亮的。有两种可能性：
一是靶蛋白本身表达水平偏低，本次阳性对照上样量不足；可以在下一次实验提高总蛋白上样量（上调 1.5‑2 倍）复测；
二是靶蛋白降解丢失，单纯加大总上样量也无法改善。

阳性对照条带严重过曝、拖尾、泳道底部出现弥散，说明上样过载。过载之后反而会造成条带变形，甚至背景升高，不利于结果判读，这时需要降低上样量。

实操的解决思路

当不确定阳性对照合适上样量的时候，可以做梯度预上样：同一管阳性对照，同时上 20 μg、40 μg、60 μg 三个梯度，跑同一块胶。孵育显影之后，找到条带明亮又不过曝的那一档，作为后续正式实验的阳性对照上样量。
梯度预上样是消除上样量不确定性最稳妥的手段。

小结：
BCA 定量是事前参考；丽春红、内参用来排查严重上样失误；最终以靶蛋白显影条带的亮度是否合适来判断；内参亮不等于靶蛋白足够；拿梯度上样预实验可以确定该份阳性对照最合适的上样质量。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司