抗体孵育时，如何确定阳性对照样本是否正常？

阳性对照的核心含义：该样本理论上确定可以表达目标靶蛋白，用来验证整套 WB 体系（一抗‑二抗‑孵育‑显影）能不能正常检出信号。但阳性对照本身也有可能出问题，不能默认买来或者文献写过它就一定能用。

1、先确认样本的理论基础

首先查阅文献、产品说明书，明确这个细胞 / 组织确实高表达该靶蛋白。
有的蛋白存在组织特异性，有些细胞系经过传代之后蛋白表达会下调甚至丢失；比如部分肿瘤细胞长期传代之后抗原表达丢失。不要只凭旧文献就直接当作阳性对照。
如果是组织样本，留意生理状态：动物的年龄、发育阶段、是否造模处理。有些蛋白只在胚胎期表达，成年动物组织表达很低，拿来做阳性对照就会失效。

2、从样本制备层面判断对照样本质量

蛋白是否发生降解

提取完蛋白之后观察蛋白裂解液，正常澄清；如果裂解液浑浊，反复冻融次数很多，提示蛋白有可能被蛋白酶降解。
SDS‑PAGE 上样前可以看蛋白电泳总蛋白情况：上样后看内参（GAPDH、β‑actin）。

阳性对照样本的内参条带必须清晰完整。
如果阳性对照的内参已经变弱、弥散、出现降解拖尾，说明样本总蛋白已经降解，就算理论上是阳性样本，此时也不能作为有效阳性对照。靶蛋白很可能也被降解掉了。

上样量是否足够

阳性对照优先选择高表达样本，上样量不要太少。细胞裂解物一般 20‑40 μg；组织裂解物可以 20‑50 μg。
不要和待测样本用完全一样的低上样量；阳性对照可以适当多上一点蛋白，保证靶蛋白的量足够被抗体检测出来。
注意也不要过载，上样量太高会造成条带拖尾、杂带增多。

储存历史核查

样本反复冻融是最大隐患。阳性对照裂解液提前分装，‑80℃保存；反复冻融 3 次以上，靶蛋白含量会逐步下降，不再适合做阳性对照。
如果是已经跑胶留存的蛋白样品，存放超过半年以上活性也有可能衰减。

3、用已验证合格的抗体先校验阳性对照（准）

如果手上还有一支确认活性完好的同靶点抗体，拿这支抗体跑一次这个阳性对照样本。

可以跑出预期分子量的清晰条带：证明这份阳性对照样本本身没问题。

依旧没有条带或者信号极弱：这份样本已经失效，不能再继续当做阳性对照。

很多实验室没有备用合格抗体，这时就只能依靠同一张膜的内参 + 丽春红辅助间接判断：

丽春红染色：转膜之后，阳性对照泳道可以看到明显总蛋白，证明蛋白成功转移到膜上，没有在上样或者转膜环节丢失。

内参条带明亮整齐，没有降解拖尾，说明样本蛋白整体保存状态是好的。

⚠️这里是间接证据：内参正常只代表样本总蛋白没有降解，并不能百分百保证目标靶蛋白还存在。有可能靶蛋白特异性下调，但管家内参不受影响。这是间接校验的局限。

4、实验结果层面如何判读本次阳性对照是否发挥作用

孵育显影之后分几种情况：

阳性对照出现预期大小的条带，内参正常。✅说明阳性对照样本正常；同时整套孵育‑抗体‑显影体系没有问题。待测样本没有条带就是待测样本本身表达低。

阳性对照无靶蛋白条带，但是阳性对照泳道内参条带清晰。⚠️这时有两种可能性：一是阳性对照样本本身靶蛋白丢失；二是一抗失效或者孵育条件错误。这时就无法区分，更换另一来源的阳性对照再做一次验证。

阳性对照的内参就弥散、很弱。❌样本蛋白已经降解，本次阳性对照结果全部无效，不能用来做任何判断。

5、实操中选择阳性对照的小建议

优先两种来源：
种，商业化的阳性对照蛋白（重组纯化蛋白）。优点最稳定，不存在细胞传代丢失、组织取材差异的问题；直接点样或者和样品一起上样。缺点只能验证抗体识别抗原，无法验证完整的蛋白提取流程。
第二种，实验室留存的、既往实验曾经明确跑出过目的条带的细胞 / 组织裂解分装样本。这是最可靠的生物学阳性对照，因为历史结果已经证明该样本可以检出靶蛋白。不要临时随便选一个文献写过但自己从来没验证过的细胞直接当做阳性对照。

简短总结关键点：
阳性对照是否正常不能只看文献。先看内参判断总蛋白有没有降解；优先选用自己实验室既往实验成功跑出条带的分装样本；内参完好不等于靶蛋白一定还在；最可靠是重组蛋白或者历史验证过的裂解样品。如果阳性对照泳道内参完好却不出靶条带，不能直接判定抗体失效，应当优先怀疑阳性对照样本本身靶蛋白缺失，更换对照样本复测。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司