除了孵育盒和塑封袋，还有哪些抗体孵育方法？

1. 平皿（培养皿）孵育

可以用细胞培养皿，6 cm、10 cm 培养皿都能用。把转好的膜平铺在皿底，加入抗体稀释液，盖上皿盖。

适合短时间室温孵育二抗，不太推荐直接用来 4℃过夜一抗。培养皿盖子只是搭上去，密封性很差，过夜水分挥发很严重，很容易干膜。使用的时候尽量让抗体液体完全覆盖整张膜，放在摇床上低速晃动。为了改善蒸发问题，可以在培养皿内部的角落放一小团浸湿的滤纸，不要接触膜和抗体溶液，靠皿内湿度减少挥发。即便做了加湿处理，依旧不建议过夜，优先室温短时间孵育二抗。多张膜不能叠放，一张皿放一张膜。缺点是抗体消耗量大。

2. 抗体滴敷法（直接敷抗体，不浸没，也叫膜上滴加孵育）

这个方法目的是极度节约抗体。把 PVDF 或者 NC 膜放在干净的 Parafilm 封口膜平面上，蛋白面朝上，吸取稀释好的抗体溶液，均匀滴加到整张膜表面，再拿另外一张同样大小的封口膜轻轻盖在抗体液滴上面，形成一个液体夹层，不要按压，避免把抗体挤跑。整个放置在密闭潮湿的环境里面，比如垫湿滤纸的密封饭盒内孵育。

这个方法风险很高，最大隐患就是局部液体蒸发干膜，非常考验湿度环境。更适合小尺寸膜、室温短时间孵育。4℃过夜不推荐，夹层很容易局部失水。盖上层封口膜的时候尽量不要带入气泡，气泡位置会出现孵育缺失的斑点。滴敷法抗体用量最少，但重复性不如浸没式，膜表面抗体厚度不均一的时候条带强弱会有差异。

3. 离心管孵育

选取合适大小的离心管，15 mL、50 mL 离心管，将膜轻柔卷成松散圆筒，蛋白面朝内，放入离心管中，倒入抗体稀释液，盖紧管盖。之后放到翻转摇床上面做颠倒翻转孵育，不要用普通水平摇床。依靠翻转滚动让管内抗体不断流过膜表面实现结合。

适合窄条膜，比如裁剪之后的单条目的蛋白膜。优点抗体用量比大孵育盒少。注意卷膜不要卷得过紧，膜层之间不能贴死，太紧夹层没有液体流过，会出现局部孵育不到位。管盖一定要拧紧防止挥发。4℃过夜可以用，但每根离心管尽量只放一张膜。缺点是大尺寸的膜卷不进去，膜卷曲之后边缘容易发生折叠，折叠位置会产生印记。

4. 自制保湿密封盒孵育

利用普通带扣密封保鲜盒，盒底铺几层浸湿但不滴水的滤纸，把装有抗体和膜的浅平容器放在湿滤纸之上，关上保鲜盒。相当于在外层搭建一个高湿度的小腔体，降低内部液体的蒸发速度。它本身不是直接盛装抗体，属于外围保湿方案，可以配合培养皿或者浅托盘一起使用，本身不能单独盛放抗体。主要用来改善短时间滴敷孵育的干膜风险。

5. 商业化抗体孵育托盘 / 孵育槽

属于实验室成品，狭长的硬质塑料凹槽，槽很浅，刚好可以平铺 WB 膜，倒入抗体溶液之后盖上配套的密封盖子。介于普通孵育盒和袋子之间。盖子密封性优于普通自制培养皿，抗体消耗量又比大方孵育盒少，适合多条狭长裁剪后的膜并排平铺孵育，可以放在摇床上平缓摇动。大部分可以支持 4℃过夜。缺点属于耗材，需要额外采购。

不同方案的取舍总结

浸没式的方案，离心管、成品孵育槽，整体重复性更好，干膜风险相对可控；滴敷法、培养皿加湿属于非，更适合室温短时间孵育二抗。

4℃过夜一抗优先还是浸没体系。滴敷法虽然省抗体，蒸发风险最高，很容易出现局部抗体干涸造成顽固背景，仅适合预实验小膜短时间处理。

无论选择哪一种替代方法，核心原则不变，要么保证充足抗体液体完全浸没膜，要么搭建足够高的保湿环境，同时避免气泡、膜折叠挤压，防止局部干膜。

补充提醒，不建议直接拿封口膜把膜紧紧裹起来孵育，极易挤压挤出抗体，出现大片干膜痕迹。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司