细胞培养的时候注意事项

一、无菌控制（最关键，防止支原体、细菌、真菌污染）

所有操作必须在超净台内进行，提前开紫外消毒超净台 30 分钟，紫外结束后吹风 5~10 分钟再动手。操作前用 75% 酒精擦拭台面、培养瓶外壁、移液枪和枪架。双手戴手套，手套碰到台面、瓶口外侧等污染区域要及时更换，不要用手触碰枪头尖端、培养瓶瓶口内侧。液体倾倒、开盖操作尽量靠近超净台中部，瓶口保持斜向下，不要长时间敞口。所有培养基、胰酶、PBS 等试剂，开封后都在超净台内取用。定期做支原体检测，支原体肉眼看不到，会缓慢影响细胞状态、转染和蛋白表达，是 WB、细胞功能实验的常见隐性干扰源。

二、培养环境维持

二氧化碳培养箱设置 37℃、5% CO₂，CO₂用来维持培养基碳酸氢盐缓冲体系。箱内水槽保持无菌水，维持湿度，防止培养基蒸发浓缩。定期清洁培养箱，擦除残留培养基，避免霉菌滋生。培养瓶不要堆叠过密，保证瓶间气体交换；尽量不要频繁开关箱门，减少温度和 CO₂波动。

三、培养基与试剂管理

培养基提前放到 37℃水浴预热，不要长时间高温水浴，避免血清蛋白变性。血清建议分装冻存，避免反复冻融。培养基添加双抗（青霉素 - 链霉素）只用于初期防污染，长期传代尽量少用，双抗会掩盖轻微污染，还可能对部分细胞产生毒性。培养基出现浑浊、变色、絮状物直接丢弃。注意胰酶的保存，胰酶在常温下活性下降快，平时 4℃存放，消化时再取用。

四、细胞传代操作要点

观察细胞汇合度，大多数贴壁细胞在 70%~85% 汇合时传代，不要长到 100% 满瓶，细胞接触抑制、老化，蛋白表达会发生改变。吸走旧培养基，用无菌 PBS 轻柔漂洗一次，去除残留血清，血清会抑制胰酶活性。加入胰酶，室温或者 37℃短暂孵育，显微镜下看到细胞变圆、间隙增大就立刻终止消化，不要过度消化，否则细胞破损、凋亡增多。加入含血清培养基吹打，吹打动作轻柔，不要产生大量气泡，气泡会损伤细胞膜。吹打均匀后按合适比例分瓶。传代比例不要一成不变，根据细胞生长快慢微调。

五、细胞观察与质控

每天显微镜观察细胞形态、贴壁情况，留意是否有小黑点、菌丝、漂浮碎片。正常细胞形态稳定，轮廓清晰；一旦出现颗粒增多、大量漂浮死细胞、形态拉长皱缩，就要排查原因。做好传代记录，记录传代时间、汇合度、细胞代次。尽量控制细胞传代总数，高代次细胞容易发生基因型、表型漂移，蛋白表达量改变，直接影响 WB 结果。实验尽量使用低代次细胞，必要时提前冻存种子细胞。

六、细胞冻存与复苏

冻存采用慢冻原则，常规冻存液是培养基 + 血清 + DMSO，DMSO 终浓度一般 10%。细胞消化离心后重悬于冻存液，分装冻存管，放入程序降温盒，-80℃过夜，之后转移到液氮长期保存。复苏遵循快融，37℃水浴快速融化冻存管，融化后立刻稀释离心去除 DMSO，DMSO 常温下对细胞有毒。复苏后天观察细胞贴壁和存活状态。

七、针对 WB / 蛋白实验的额外注意

收集细胞前评估细胞状态，细胞应激、凋亡、污染都会改变目标蛋白表达。收样前避免培养基长时间缺营养、pH 变化。细胞裂解前充分吸净培养基，PBS 洗涤去除血清残留，血清中的蛋白会干扰后续 WB。如果需要检测磷酸化蛋白，全程尽量低温，裂解液内加入磷酸酶抑制剂，减少蛋白去磷酸化。

八、常见避坑点

不要把培养瓶盖子完全拧紧，保留少量缝隙透气（透气盖除外）。不要把废液长时间放在超净台内。不要混用不同细胞系的枪头、培养瓶，防止交叉细胞污染。水浴锅定期清洁，水浴锅是真菌污染高发位置。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司