竞争ELISA的包被温度选择37℃时，需要注意什么？

选用三十七摄氏度做竞争 ELISA，特别是表位肽体系，首先要清楚这个温度的短板，吸附平衡快，但更容易引入不稳定因素，所有配套操作都要围绕降低波动、控制背景、保住竞争窗口来做。

温度本身要保证稳定，不能把板子放在开关频繁的培养箱门口，箱内提前预温，尽量不要有温度梯度，箱体里不要同时放大量其他板子或者液体，避免局部降温。不要用水浴简易加热，板面受热不均会造成同一块板不同孔信号离散，板内 CV 直接拉高。孵育期间一定要严格封膜，三十七摄氏度蒸发速度远高于四度，一旦孔内液体浓缩，肽局部富集，疏水肽会聚集析出，背景飙升，固相表位构象改变，后续游离肽很难竞争，抑制率掉下来。封膜尽量用密封效果好的压敏膜，而不是简单盖盖子，盖子缝隙的蒸发差异足够造成孔间偏差。

包被时长不能贪长，被动吸附的短肽一般控制在一到三小时。随着时间继续拉长，信号可能还会小幅上升，但新增的信号大多是非特异疏水吸附，不是可被游离肽竞争的特异性表位。疏水肽尤其危险，长时间三十七度孵育容易发生聚集，吸附在板上之后构象和游离单体肽不一样，竞争反应失效。梯度摸索的时候，不能只看零孔 OD，必须同步追踪最大抑制率，如果延长时间之后抑制开始下滑，就要缩短孵育时长。

包被液和肽的溶解度要提前验证，三十七度下有机溶剂、高浓度助溶剂更容易诱发肽析出，配制好的包被工作液可以先放在三十七度静置观察一段时间，如果出现浑浊，就要降低肽浓度或者调整缓冲液，不能直接上板。如果肽本身稳定性差，三十七度长时间放置会发生降解，信号持续走低，这种情况就不适合选用这个温度。

起始加样尽量在低温环境完成，不要把配好的肽工作液提前放在三十七度预热，配好之后快速加样，封膜之后再放入预温好的培养箱，防止在加样过程中就出现析出或者降解。孵育结束之后，尽快取出板子，不要在箱内缓慢降温，取出之后立刻进行洗板，终止吸附过程，避免肽继续在不稳定的条件下结合或者聚集。

还要留意吸附可逆性，三十七摄氏度吸附上去的肽，相比四度过夜，结合牢固度通常偏弱，后续洗板不能力度过大，洗板液里面吐温浓度要偏低，抽吸不要紧贴孔底，否则容易把刚吸附上的肽洗脱，信号掉得厉害。洗板的程序要固定，不要随意增加次数或者浸泡时间。

对照设置不能简化，每一次都带上无包被孔、无关肽包被孔，用来区分真正特异性信号和高温带来的非特异吸附。如果无关肽孔信号跟着升高，说明当前条件下疏水吸附占主导，就算零孔信号好看，竞争体系也不可靠。另外，三十七摄氏度的条件本身重复性天生弱于四度过夜，如果后续做标准曲线、样本检测，需要评估连续多板的板间变异，如果变异超出接受范围，即便其他参数合适，也应当换回低温包被。

记住，一旦选定三十七摄氏度，整套参数就要绑定，包被浓度、时长、洗板流程都不能直接照搬四度条件，高温下的吸附动力学不同，之前在低温摸索出来的包被浓度很可能不再合适，需要重新走一遍梯度，确认信号、信噪比以及竞争抑制窗口。如果后续需要长期定量，三十七度更适合预实验快速筛查，正式定量优先选择四度过夜，除非肽本身在低温下溶解度不好，只能选用较高温度。

来源：上海笃玛生物科技有限公司