如何确定竞争ELISA的最佳包被时长？

如何确定竞争ELISA的最佳包被时长？

确定竞争 ELISA 的最佳包被时长，核心不是单纯看到达饱和信号，而是在固定包被温度与包被浓度的前提下，找到既能获得稳定固相表位、又保留足够竞争抑制能力的最短时长，并且控制背景与板间变异，对于表位肽体系尤其如此。

先固定其余所有变量，包被缓冲液、包被肽浓度、每孔加样体积、封闭方案、抗体稀释度都保持不变，只设置时长梯度。如果选用四度包被，梯度可以从四小时、八小时、十二小时、十六小时到二十四小时排布，如果是三十七度，梯度设置一小时、两小时、三小时、四小时就足够。每一个时长点都同时带上无包被空白孔、无关肽包被孔，以及零竞争孔和高浓度游离肽竞争孔。

读取信号之后先观察零竞争孔 OD 的变化，随着时间延长，OD 逐步上升，当延长时长之后 OD 不再明显增加，说明固相吸附趋于饱和。但竞争体系不能直接选择最长的饱和时间，长时间孵育有可能让肽发生聚集，非特异吸附同步抬升，甚至改变固相肽的构象，导致游离肽难以竞争，最大抑制率下降。所以要同步查看最大抑制率和信噪比，优先选取刚好接近信号平台、同时高浓度游离肽可以实现充分抑制，空白和无关肽信号偏低的时长。

如果在四度条件下，十二小时和十六小时的零孔 OD、抑制率、变异都差别不大，优先选择更短的那一个，减少过夜过程中缓冲液微量蒸发、微生物污染带来的波动。如果时长不足，即使后续其他条件拉满，固相上可识别表位总量偏少，信号偏低，CV 变大，标准曲线线性变差。三十七度包被时要留意，过长孵育容易让疏水肽析出或者局部浓集，背景快速上升，一般很少超过三小时。

还要区分吸附机制，如果是被动吸附短肽，吸附是一个缓慢平衡过程，对时长更敏感，如果是生物素肽结合链霉亲和素板，反应速率快很多，通常一到两小时就能达到结合饱和，不需要长时间孵育。包被全程必须封膜，蒸发会造成局部浓度升高，让同一时长组内部差异变大，干扰判断结果。

初选得到时长之后，需要做重复性验证，用这个时长连续包被多块板子，评估板内和板间变异。如果变异偏高，即使 OD 和抑制率看起来不错，这个时长也并不适合用于定量检测。一旦确定最佳时长，后续所有实验都固定这个时间，不要随意增减，包被时长和包被温度是耦合的，改变温度之后整套时长梯度需要重新摸索。

还要记住，包被时长只是其中一环，如果调整时长之后，最大抑制始终达不到预期，很多时候并不是时间不够，而是肽本身吸附能力弱或者固相构象和游离肽不一致，这时单纯延长孵育时间很难解决根本问题，需要转向载体偶联或者更换固定方式。

来源：上海笃玛生物科技有限公司