表位肽ELISA的竞争反应中，高浓度游离竞争肽的固定体积应该如何确定？

表位肽ELISA的竞争反应中，高浓度游离竞争肽的固定体积应该如何确定？

这里针对间接竞争表位肽 ELISA，核心一句话：高浓度游离竞争肽不是按固定体积定，是先定终浓度、再定体系，体积选择要兼顾液相预平衡、固相表位负荷、以及移液误差，同时要和包被肽、一抗体系匹配。

先明确这个 “高浓度竞争肽” 的用途，它是用来评估最大抑制，也就是 Bmin，用来判断这套体系能不能压下去信号、拿到最大抑制率，不是标准曲线上的常规点。实验里常见两种模式：先预混（游离肽 + 一抗预孵育，再加到包被板）；或者先加游离肽孵育，再加一抗。前者对短肽低亲和力体系更可靠。

体系总体积优先固定。一块 96 孔板，单孔常用总反应体积是 50 μL 或者 100 μL，不建议随便混用。如果选总体系 100 μL，可以设置游离肽母液加样体积 20 μL，一抗工作液 80 μL；或者各 50 μL 等体积预混。等体积预混是最推荐的，操作简单，稀释因子可控，也方便做系列梯度，包括最高竞争点。不建议游离肽只加几微升，体积太小会带来巨大移液相对误差，尤其是低溶解度、容易吸附管壁的短肽。游离肽加样体积一般不要低于总体系的 20%， ≥25 μL，在单孔总体系 50–100 μL 的框架内。

接下来是浓度层面，比体积更关键。最高竞争点的目标终浓度，要足够过量，达到 “饱和竞争”，也就是再多游离肽，抑制率不再明显上升。实操上可以先做一个竞争滴定，固定一抗，设置一系列递增游离肽终浓度，直到 OD 进入平台最低点，这个平台对应的最低浓度，就是你后续固定使用的高竞争终浓度，而不是凭经验随便配一个。很多表位肽体系，这个饱和竞争终浓度会远高于固相表位的摩尔量；短肽亲和力弱，需要摩尔大幅过量才能把抗体从固相表位上抢下来。如果这个最高点抑制达不到 75%–85% 以上，要么是竞争浓度还不够，要么是固相肽和游离肽的表位构象不等价，或是抗体识别偏好固相吸附状态下的肽，这种情况就算调体积也解决不了。

体积选择还要考虑几个约束。如果游离肽储备液溶解度有限，浓度不能做太高，那就要分配更大的加样体积，同时相应减少一抗稀释液体积，保证总体积不变，不能溢出孔、也不能液面太低容易干板。如果肽很贵，溶解度好，母液可以配浓一点，加样体积可以偏小，但依然避开小于 10 μL 的加样，降低 CV。另外，如果你的流程是先加游离肽孵育固相，再加一抗，游离肽体积可以占到绝大部分；但这个模式对低亲和力表位往往抑制偏弱，一般不作为。

还要和前面确定的包被条件联动。固相上的表位总量越高，需要用来饱和竞争的游离肽摩尔量就越高。如果你之前选了偏高的包被肽浓度，固相位点多，想要达到最大抑制，游离肽终浓度就要往上抬，单纯改体积没有用，体积只负责稀释。选定体积与总体系之后，不能单独改动游离肽加样体积，否则终浓度会偏移；所有孔，包括零竞争孔，都要保持完全一样的加样体积结构，零竞争孔用同样体积的稀释液替代游离肽，保证一抗稀释倍数、缓冲环境完全一致，排除稀释效应带来的假抑制或者假升高。

配套质控点，选定方案之后，用这个最高竞争点连续测多孔，看 CV，同时对比无关肽同体积同浓度对照，排除肽本身带来的基质效应或者非特异沉淀吸附。如果高浓度肽本身会造成沉淀，或者改变缓冲液 pH、加入有机溶剂，那即使体积合适，也会让 OD 异常，这时就要降低母液浓度、调整溶剂，而不是继续加大体积。

一个稳定的常用方案可以直接拿来试，单孔总反应体积 100 μL，游离竞争肽工作液 50 μL，一抗工作液 50 μL，等体积预混之后孵育；零竞争孔用 50 μL 肽稀释液加上同样 50 μL 一抗。如果肽稀缺，改用总体系 50 μL，游离肽 25 μL，一抗 25 μL。确定体积结构之后，再去滴定游离肽终浓度，直到抑制平台出现。

来源：上海笃玛生物科技有限公司