表位肽ELISA的包被肽浓度应该如何确定？

表位肽ELISA的包被肽浓度应该如何确定？

对于表位肽 ELISA，包被肽浓度不是一个固定数值，核心目标是找到饱和固相、同时留给竞争反应足够信号窗口的浓度；竞争型和直接型思路不一样，下面主要以最常用的间接竞争表位肽 ELISA 来讲。

先区分两个概念，被动吸附短肽和偶联肽。单纯游离短肽被动吸附能力弱，很多亲水肽很难挂上，这时候不要盲目拉高浓度，优先考虑肽偶联载体蛋白或者生物素标记链霉亲和素固定；如果是肽‑载体偶联物，吸附更接近普通蛋白，滴定会更稳定。

常规初筛梯度可以设置为 0.5、1、2、5、10、20 μg/mL，用碳酸盐包被液 pH 9.6，每孔加固定体积，4 ℃过夜包被。搭配一个固定的一抗稀释度先跑一次方阵，看零竞争孔的 OD。如果零孔 OD 随着包被浓度上升持续走高，还没有进入平台，说明固相还没有饱和；当继续提高包被浓度，零孔 OD 上升变得平缓，进入平台区，这个平台起点就是固相饱和浓度。一般我们不取平台最高一点，而是取刚刚达到平台或者平台前一点的浓度，这一点固相表位充足，又不会因为包载过多造成肽容易解离、背景飙升、竞争抑制窗口压缩。

如果是竞争 ELISA，不能只看饱和，还要看抑制率。在每个包被浓度下加入固定高浓度游离竞争肽，计算抑制率。过低的包被浓度，零孔信号太低，信噪比差，CV 变大；包被过高时，固相表位位点太多，游离肽很难竞争下来，IC50 变大，整条曲线变平，抑制率上不去。浓度是在该条件下既能让零竞争 OD 落在 1.2 到 1.8，同时高浓度游离肽可以实现大于 80% 甚至接近 90% 的抑制。

如果你的肽疏水很强，高浓度包被之后背景快速抬升，就算信号上去，空白和无关肽对照 OD 同步升高，这时就要妥协，选择可以维持合理信噪比的更低浓度，而不是一味追求饱和。亲水短肽经常出现，哪怕加到 20 μg/mL，信号依然很低，这不是浓度不够，而是被动吸附不适合，需要切换固定策略。

配套的对照必须同步带上，无包被空白孔、无关肽包被孔、单独载体蛋白包被孔。如果提高包被浓度之后无关肽孔同步升高，说明增加的信号大部分是非特异疏水吸附，不是特异性表位结合，这个梯度就无效。

确定之后还要联动一抗方阵。包被肽浓度和一抗稀释度是耦合的，选定包被浓度之后，再滴定一抗，反过来，如果一抗亲和力很低，就算包被饱和，信号依然偏弱，可以适度上调包被浓度，但同时要预判竞争窗口会收窄。

还有几个细节。包被体积要统一，蒸发会造成局部浓度虚高；包被液不要用 PBS，会降低吸附效率；如果是生物素肽，就不再用质量浓度直接对标被动吸附，改用链霉亲和素板上的生物素肽梯度，同样以饱和结合和竞争抑制曲线作为判定标准。如果后续实验打算用来测样本，在选定浓度之后做一次曲线验证，看 IC50、线性区间、板内 CV 是否满足你的质控标准，单纯靠饱和 OD 选出来的浓度，有时候在真实竞争体系里并不好用。

简单梳理流程，先用梯度包被找固相饱和区间，再在每个梯度下评估最大抑制率，优先挑选零孔 OD 在合适区间、抑制充分、非特异对照低的那一个；如果饱和浓度带来竞争困难，就往低浓度回落，牺牲一部分信号换取更大的竞争窗口。

来源：上海笃玛生物科技有限公司