介绍一下 RT-PCR 的原理

介绍一下 RT-PCR 的原理

RT-PCR 全称逆转录聚合酶链式反应，核心分为两大阶段，先逆转录，再 PCR 扩增。首先提取样本中的总 RNA，以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下，利用引物、dNTP 等原料，合成与 RNA 互补的 DNA，也就是 cDNA。RNA 是单链且容易降解，cDNA 稳定性更高，可作为后续 PCR 反应的模板。

接下来进入 PCR 扩增阶段，以合成得到的 cDNA 为模板，加入特异性上下游引物、Taq DNA 聚合酶和 dNTP，通过温度循环完成目的片段的扩增。PCR 的温度循环包含三步，高温变性让双链核酸解链，降温退火使引物结合到模板上，适温延伸让 DNA 聚合酶沿着模板合成新链。不断重复变性、退火、延伸，靶标 cDNA 片段呈指数级扩增。

日常科研中最常用的是荧光定量 RT-PCR，也就是 RT-qPCR，在 PCR 体系里加入荧光基团。每扩增出一条新的 DNA 链，荧光信号就会相应增强，仪器实时监测荧光强度。样本初始模板越多，荧光达到设定阈值所需的循环数 Ct 值就越小，以此实现对原始样本中 mRNA 的定量。

需要注意，RT-PCR 检测的是 mRNA，代表基因转录水平。样本中如果混有基因组 DNA，会造成非特异性扩增，一般会设置无逆转录对照排除 DNA 污染。同时 mRNA 的含量只反映转录水平，不能直接等同于最终蛋白表达量，存在转录后调控、翻译调控等环节影响蛋白生成。

精简版本（方案可用）：
RT-PCR 即逆转录 PCR，分为逆转录和 PCR 扩增两步。首先以样本 RNA 为模板，在逆转录酶催化下合成互补 cDNA；再以 cDNA 作为模板，依靠特异性引物与 Taq 酶，经多轮变性、退火、延伸循环实现目的片段扩增。荧光定量 RT-PCR 通过实时采集荧光信号，依据 Ct 值对原始 mRNA 进行定量，用于评估基因转录水平。

来源：上海笃玛生物科技有限公司