ELISA检测时，如何排除其他抗体干扰？

ELISA检测时，如何排除其他抗体干扰？

ELISA 里最常见的干扰抗体主要包括异嗜性抗体、人抗动物抗体（HAAA）、类风湿因子 RF、自身抗体、样本中残留的治疗性抗体，它们可以桥接捕获抗体与检测抗体，不依赖靶抗原就产生假阳性；也可以结合抗原，阻断抗原与包被 / 检测抗体结合，造成假阴性。下面按样本前处理、体系添加阻断试剂、抗体试剂层面优化、实验对照设计四个维度说明。

一、样本前处理手段

样本稀释适度稀释样本可以降低干扰抗体浓度。干扰抗体亲和力通常低于特异性抗体，稀释后干扰效应衰减更明显；但稀释同时靶抗原浓度也下降，不能无限稀释，需要做稀释线性验证。仅适合干扰程度较轻的样本，强干扰样本效果有限。

热处理56℃水浴 30 min 灭活部分不稳定的异嗜性抗体、类风湿因子。注意：高温会破坏待测抗原，仅适合抗原耐热的体系；蛋白类细胞因子很多不耐热，不能用。

沉淀 / 吸附去除使用聚合兔 IgG、小鼠 IgG 固相吸附剂，或 Protein A/G 磁珠，从样本中预先清除内源性 IgG。适合高滴度干扰样本；缺点是可能共沉淀待测抗原，需要验证抗原回收率。

二、反应体系添加阻断试剂（最常用）

异嗜性抗体阻断剂（HBR）商品化 HBR 多为混合动物 IgG，加入样本稀释液中。原理：游离动物 IgG 预先结合样本中的异嗜性抗体，阻止其桥接捕获和检测抗体。适合人血清、血浆样本，夹心 ELISA 。

注意：要匹配捕获 / 检测抗体的宿主种属，比如一抗是小鼠来源，就加入小鼠 IgG。

正常动物血清在样本稀释液中加入与一抗同宿主的正常血清（5%~10%），血清里大量无关 IgG 竞争性结合样本中的 HAAA / 异嗜性抗体，降低桥接。这也是很多自建 ELISA 常规方案；缺点是血清批次差异大，部分血清自带杂抗体，反而抬升背景。

非特异性 IgG单独加入无关宿主 IgG（如小鼠 IgG），相比全血清成分更简单，背景波动更小。

三、试剂与实验体系优化（从源头减少被干扰的机会）

抗体宿主搭配策略捕获抗体和检测抗体尽量选用不同宿主来源，减少异嗜性抗体同时识别两个抗体的概率。比如捕获用兔源，检测用羊源；若捕获和检测都是小鼠单抗，异嗜性抗体极易桥接，假阳性风险显著升高。

选用 F (ab’)₂片段代替完整 IgG异嗜性抗体大多识别抗体 Fc 段。使用去掉 Fc 段的 F (ab’)₂作为捕获 / 检测抗体，消除 Fc 介导的桥接，可大幅降低 HAAA、异嗜性抗体干扰；成本更高，抗体活性需要重新验证。

优化抗体浓度不要使用过高浓度捕获 / 检测抗体。过量抗体容易被干扰抗体结合；在保证特异信号前提下，滴定到最低有效工作浓度。

基质稀释液的设计样本稀释液除蛋白（BSA）、Tween20 之外，预先加入阻断 IgG，不要只用单纯 PBS 稀释样本。

四、设置对照，识别干扰（区分真阳性 vs 抗体干扰）

仅做阻断还不够，必须设置对照来判断是否存在抗体干扰：

空白对照、阴性基质对照：评估本底。

样本稀释线性试验：真实抗原随稀释，OD 按比例下降；抗体干扰的假阳性，稀释后 OD 下降不成线性，甚至下降很慢。

加标回收实验：向样本中加入已知量靶抗原，看回收率。若干扰抗体阻断抗原结合，回收率偏低；若存在桥接假阳性，基线异常抬高。

抗体阻断验证孔：同一份样本分两份，一份加 HBR，一份不加；加阻断剂后 OD 明显下降，提示存在异嗜性抗体干扰。

抗原中和实验：样本预先用过量重组抗原孵育。真阳性信号会被抗原中和降低；异嗜性抗体造成的假阳性，信号基本不变。

五、特殊干扰抗体的针对性处理

类风湿因子 RF：RF 可以结合 IgG Fc 段，常造成假阳性。F (ab’)₂片段、HBR、56℃灭活都可以减弱 RF 干扰。

治疗性单抗：临床样本中注射的药物抗体，会直接结合包被抗原或检测抗体。这种情况 HBR 效果有限，需要选择识别抗原不同表位的配对抗体，或选用不识别药物抗体的试剂。

自身抗体：部分自身抗体直接结合靶抗原，造成假阴性，此时阻断 IgG 效果有限，只能更换识别表位的抗体对。

六、局限性

阻断试剂不能 100% 消除所有干扰，只能降低概率。部分高滴度、高亲和力异嗜性抗体，即使加 HBR，仍有残留干扰。所以不能只依赖阻断，必须搭配对照实验来验证结果可靠性。

方案精简段落（可直接粘贴）

样本中异嗜性抗体、人抗动物抗体、类风湿因子等内源性抗体可通过桥接捕获 / 检测抗体产生假阳性，或结合靶抗原造成假阴性。可通过样本稀释、合适条件热处理、固相 IgG 吸附预处理样本；在样本稀释液添加异嗜性抗体阻断剂或同源正常动物 IgG 进行竞争性阻断；优先选择不同宿主来源的配对抗体，或采用 F (ab’)₂片段抗体去除 Fc 段结合位点。同时设置稀释线性、加标回收、阻断对照、抗原中和对照，区分真实信号与抗体干扰。阻断方法存在局限性，需结合多重对照共同评估结果可靠性。

来源：上海笃玛生物科技有限公司