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技术文章
三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较
点击次数：3198 发布时间：2020/5/12 11:25:21
1.3.2 染样品法 同时制备四块不加染料的1％琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽中。将分别将0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000与4种染料混合，避光10 min.然后于不同泳道中加入。使用5V/cm的电压进行电泳，最后用凝胶成像系统观察拍照。
1.3.3 后染法 同时制备四块不加染料的1％琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽中。于不同泳道中分别加入0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000.使用5V/cm的电压进行电泳。电泳后将凝胶分别浸入用1×TAE稀释的4种不同染液中。按照说明书要求，GoldViewna II、GoldView、DNA Green及EB避光染色的时间分别为60 min、30 min、30 min、30 min.DNA Green染色完毕后还需用1×TAE脱色30 min.最后用凝胶成像系统观察拍照。
2 结果与分析
2.1 染胶法
染胶法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度均最高，其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为0.5 ng；EB能检测到的DNA含量约为1 ng；GoldView与DNA Green能检测到的DNA含量约为2 ng.
2.2 后染法
后染法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度低于染胶法。其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为1ng；EB能检测到的DNA含量约为2 ng；DNA Green与GoldView能检测到的DNA含量约为5 ng.图2 使用后染法比较4种核酸染料染色DNA的灵敏度
2.3 染样品法
染样品法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度最低。其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为2 ng；EB与DNA Green能检测到的DNA含量约为5 ng、GoldView能检测到的DNA含量约为10 ng.
3 讨论
GoldViewna II是国内近年来推出的新型核酸染料，与SYBR Green I同属花青类染料。SYBR Green I是几年前推出的一种高灵敏度［3］且不具有强致突变性［4］的核酸染料，但由于其高昂的价格限制了它的广泛使用。上述实验表明GoldViewna II的灵敏度高，同时具有花青类染料不具强致突变性的优点，价格也比SYBR Green I便宜数倍。虽然其稳定性不如EB［3］且反复冻融效果变差，但只需要-20℃避光保存和分装使用即可。
DNA Green是国内最近才推出的新型核酸染料。它的灵敏度与EB相当但背景略高于EB，但该染料的价格比GoldViewna II还便宜且稳定性比较好，4℃避光保存即可。
GoldView是国内较早使用的新型核酸染料，它的灵敏度比EB略低且背景太高。不适合做微量的DNA检测。但该染料稳定性也比较好，4℃避光保存即可，价格是这三种染料中最便宜的。
这些新型核酸染料均可替代EB广泛使用，从而减少大量使用EB对人体的危害和对环境的污染。使用者可以根据自己的需要选择合适的染料。
染色方法比较可以看出：染胶法的检测灵敏度最高；后染法的检测灵敏次之；染样品法的检测灵敏度最低，不适合做微量DNA检测。此外，后染法用于新型核酸染料很不合适。花青类染料用于后染法需要将染料用1×的电泳缓冲液稀释到聚丙烯容器中，在避光条件下该溶液最多可以在24小时内被使用且染2～3块凝胶后其灵敏度会降低，结果略。这样的结果导致染料的巨大消耗，成本太高。DNA Green用于后染的工作浓度为10×，也就是染料用量提高10倍即成本增加10倍，而且在染色半小时后，由于其高背景还需要脱色半小时，延长了实验时间。既往有研究推荐使用后染法的原因是染色的DNA带型平直不扭曲［2］。我们的实践经验得出，电泳时控制合适的电压和上样量，新型核酸染料使用染胶法也能达到同样效果。故使用新型核酸染料染色DNA时推荐采用染胶法。
原创作者：上海远慕生物科技有限公司
