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技术文章
远慕解答：胰酶分装冻存时要注意什么？
点击次数：4034 发布时间：2020/3/24 14:45:37
细胞培养实验中不可或缺的除了培养基，胰酶也是非常重要的一个角色，虽然细胞培养试验基本技术大同小异，每种细胞的培养条件各不相同，但是，在细胞传代过程中都少不了这个步骤—胰酶消化。
细胞消化使用胰酶时需要了解哪些问题？
一、 细胞培养过程中为什么要使用胰酶呢？胰酶的作用是什么？
胰酶是一种蛋白酶，酶切位点是肽链的Lys或Arg两个残基的羧基端肽链，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞膜上与培养皿壁结合处蛋白降解，从而使两者分离。这时，细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力可成为球形。
图1.胰酶酶切位点
二、 使用胎牛血清培养细胞，在使用胰酶消化时发现血清可以终止此过程，这是何原因？
血清终止的原理其实是竞争抑制，就是用过量的牛血清中含有的蛋白和胰酶结合，使胰酶失去消化细胞蛋白的机会。
三、 为什么使用了胰蛋白酶消化，细胞还是成团的，这可能是什么原因导致的？
① 消化时间不够 ② 吹打力度不够 ③ 胰酶消化液浓度不够 ④ 细胞密度过高之后才消化传代 ⑤ 胰酶存储不当，或者使用了过期胰酶
四、 胰酶分装冻存时要注意什么？
胰酶分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀，多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并增大污染的可能性。
五、 怎么才能判断胰酶消化完全？
注意：不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才表示消化好了。
一般肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙状移动就可以了，就应该停止消化。
六、 胰酶适用于哪些细胞消化？它的消化效果与哪些有关呢？
胰酶适用于消化细胞间质较少的软组织和传代细胞，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对纤维性组织和较硬的癌组织效果较差。胰酶的消化效果主要与pH值、温度、胰酶浓度、组织块大小和硬度有关。
七、 胰酶中的酚红有哪些作用？
酚红在培养基中被用来作为pH指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明：酚红可以模拟固醇类激素（特别是雌激素）的作用。为避免固醇类反应，培养细胞尤其是哺乳类细胞时，建议用不含酚红的培养基。由于酚红干扰检测，在做流式细胞检测时，也会使用不含酚红的培养基或者胰酶。
图 2. Phenol red test
八、 在做细胞凋亡检测时，细胞为什么不能用含有EDTA的胰酶消化？
Annexin V（膜联蛋白）是Ca2+依赖的蛋白，EDTA会螯合Ca2+从而影响Annexin V，进而影响结果，因此需选用不含EDTA的胰酶。建议放入培养箱中进行消化，时间可以长一点。随时观察细胞情况，避免消化过度；也可使用细胞刮刀将细胞刮下，后用枪吹匀，比消化简单，还可避免使用胰酶带来的伤害。
原创作者：上海远慕生物科技有限公司
