中性粒细胞是抵御病原体的首要防线，其数量与功能对预防感染至关重要。在微生物刺激下，其产生活性氧（ROS），并释放中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和髓过氧化物酶（MPO）。NE切割组蛋白促使染色质去浓缩，MPO结合染色质进一步推动结构展开，最终形成由染色质和抗菌蛋白构成的中性粒细胞胞外陷阱（NETs），该过程称为NETosis。NETs可捕获并杀灭细菌、真菌、寄生虫和病毒，发挥重要抗菌作用。
目前中性粒细胞功能检测多集中于吞噬和氧化爆发。Timmer KD等人（2023，《Cells》）提出新方案，可同时评估吞噬、ROS生成、胞外域脱落及脱颗粒四项功能。其中，CD62L脱落反映活化状态，CD16b等分子切割调控免疫应答；脱颗粒通过CD66b标记二级颗粒释放，释放MPO、溶菌酶等抗菌成分。该方法实现了对中性粒细胞多维度功能的同步检测。
文献案例分享
一、流式检测骨髓和纯化PMN中的NETosis
1.流式检测骨髓（BM）中的NETosis：
采用流式细胞术检测骨髓PMNs经30 nM PMA刺激4小时后的NETosis，以未处理4小时组为对照。首先通过FSC-A/FSC-H和SSC-A/SSC-H设门排除双联细胞；接着圈定SSChiLy6G+的PMN细胞群；然后在Ly6G+细胞中进一步分析SO+DAPI+的PMN群体，以识别发生NETosis的中性粒细胞。
2.流式检测纯化PMN中的NETosis：
使用不同浓度PMA刺激后，通过抗CD66、DAPI和SO染色，并应用流式细胞术分析NETosis。首先，在图3A中通过FSC-A/FSC-H和SSC-A/SSC-H设门排除双联体细胞。接着在图3B中，利用FSC/SSC（R1）设门去除淋巴细胞和单核细胞的污染。图3C则根据高侧向散射特性（SSChi）及CD66表达鉴定PMN。在图3C和3D中显示，PMA处理组（PMA组）中SO+DAPI+ PMN的比例显著增加，而未处理组（UT组）背景信号为7%-20%。
二、流式检测人外周细胞NETs的综合表型分析
1.流式细胞术定量体外刺激的NET附着性中性粒细胞的门控策略：
通过SSC-AhiFSC-Ahi设门并排除双联体后，利用CD15和CD66b双阳性鉴定中性粒细胞。活中性粒细胞附着DNA结构被识别为CD15+CD66b+Zombie NIRdim7-AAD+，NET+细胞为MPO+NE+，整体表型为CD15+CD66b+7-AAD+Zombie NIRdimMPO+NE+，DNase I处理可验证NETs特异性。此外，H3cit与MPO/NE共表达可作为PAD4依赖性NETosis的标志。
2.流式细胞术监测体外NETosis：
通过密度离心分离全血粒细胞，经0-7.1 nM PMA刺激2小时后，7-AAD+Zombie NIRdimMPO+NE+的NETotic中性粒细胞呈剂量依赖性增加（图5A），而坏死细胞为7-AAD+Zombie NIR+MPO++NE++（红色箭头）。Annexin V检测显示NETotic细胞不表达凋亡标志（图5B）。FSL-1刺激后，分别用7色NET Panel（图5C）和CD11b/CD66b（图5D）染色，验证NETosis与活化状态。图5E显示不同定义的NETs对5.0 nM PMA均有响应。
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