聚乙二醇化的多肽和蛋白质为生物治疗药物的详细结构表征带来重大挑战，这主要是由于 聚乙二醇 (PEG) 具有异质性。本应用简报描述了一种联用 Agilent HPLC 及 Agilent 6520 精确质量数 Q-TOF LC/MS 系统分析聚乙二醇及聚乙二醇化蛋白的方法。其使用了一种 电荷剥离剂（三乙胺）作为柱后添加剂，这样有助于简化质谱图，因此可更好地阐释结 果。结果表明聚乙二醇和聚乙二醇化蛋白质的质谱图质量均得到显著改善。
液相色谱/质谱 (LC/MS) 技术在蛋白质表 征方面功能强大、灵敏度高。在蛋白质药 物的监管审批中，采用 LC/MS 方法来进 行定性和定量分析。聚乙二醇化是生物制 药业中一种重要的共价修饰方法，可提高 蛋白的治疗功效。1 聚乙二醇化过程指的 是聚乙二醇与治疗性蛋白的化学结合。这 种修饰可以增加蛋白药物的半衰期。但由于聚乙二醇分子本身的异质性，聚乙二醇 化修饰可导致产品的异质性。因此，在产 品发布前分析聚乙二醇试剂及聚乙二醇化 蛋白药物非常重要。本研究中，我们通过 联用 Agilent 1260 Infinity LC 及 Agilent 6520 Q-TOF 质谱仪对完整的聚乙二醇化治 疗性蛋白样品和聚乙二醇试剂进行分析。 聚乙二醇和聚乙二醇化蛋白从 HPLC 分离 及洗脱出来，而电荷剥离剂三乙胺 (TEA) 由一个注射泵通过三通接头导入，如图 1 所示。2,3 作为一个电荷降低试剂，TEA 在进入质谱仪前与聚乙二醇化蛋白样品混 合。胺类化合物的添加可改善质谱图，有 助于结果解释。结果表明所研究的聚乙二 醇化治疗性蛋白与聚乙二醇试剂一样，都 具有异质性。聚乙二醇化后，完整蛋白分 析显示出多重峰，每个峰之间的质量偏移 约为 44 Da，为乙二醇的质量。
实验部分 材料与方法 治疗性蛋白来自 GangaGen 生物技术公 司。对硝基苯碳酸盐 (mPEG PNP, 10 kDa) 来自 Creative PEG works 公司。三乙胺 (TEA) 及甲酸购自西格玛奥德里奇公司。 分析中使用的纯水及乙腈为 LC/MS 级。 治疗性蛋白 (P128) 的聚乙二醇化通过与 10 kDa 对硝基苯碳酸盐 (mPEG PNP) 以 1:5 的摩尔比反应完成。利用阳离子交换 柱去除反应混合物中未反应的聚乙二醇。 然后采用线性 NaCl 梯度洗脱结合的单、 二聚乙二醇化蛋白。 在本研究中，我们将 1260 Infinity LC 系统 与 6520 精确质量数 Q-TOF 质谱仪联用。 在 LC/MS 分析中，采用注射泵通过三 通接头以稳定流速 0−10 µL/min 在柱后添 加胺溶液（含有 1% TEA 的 50 : 50 乙腈/ 水溶液），如图 1 所示。表 1 列出了分析 中的 LC 及 MS 参数。LC/MS 的数据采用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 软件及 Agilent MassHunter BioConfirm 软件进行分析。
结果与讨论 柱后添加 TEA进行聚乙二醇的 LC/MS 分析 图 2 展示了通过柱后添加不同浓度的 TEA 所得的 10 kDa mPEG PNP 主峰的 LC/MS 质谱图。未添加 TEA 时，聚乙二醇高度 带电且所有的带电离子呈现窄分布。此时 很难通过解卷积方法从这些数据中获取聚 乙二醇的分子量分布（图 3A）。且解卷 积后的谱图中没有界限清晰的解卷积 峰。增加柱后 TEA 添加的浓度，可改善 mPEG-PNP 的电荷态分布（图 2）。聚 乙二醇的电荷态降低，可在一个较宽的 m/z 范围内产生清晰的电荷态组。图 3B 展示了在以 10 µL/min 的流速导入 TEA 时，10 kDa mPEG-PNP 的解卷积质谱 图。可清晰检测到乙二醇单元 (44 Da)。
柱后添加 TEA 进行单聚乙二醇化蛋 白的 LC/MS 分析 图 4 展示了柱后添加 TEA（流速 10 µL/ min）时，单聚乙二醇化及二聚乙二醇化 的治疗性蛋白的 LC/MS 解卷积质谱图。 解卷积后，未修饰蛋白的完整分子量约为 26,489，如图 4A 中的插图所示。图 4A 表明该蛋白经过 10 kDa 聚乙二醇分子修 饰后，质量从 26 kDa 偏移至 36 kDa。 在解卷积谱图中，可很容易地观察到含有 不同数量乙二醇单元 (44 Da) 的聚乙二醇 异质性。 LC/MS 分析还确证了蛋白的单聚乙二醇 化状态，因为除了一些未修饰蛋白的小片 段外，未观察到任何其他的片段（数据 未列出）。图 4B 展示了经 10 kDa 聚乙 二醇二聚乙二醇化修饰的 P128 的解卷积 质谱图。二聚乙二醇化蛋白的质量约为 46 kDa，证明 26 kDa 蛋白上连接了两分 子 10 kDa 聚乙二醇。此时在解卷积谱图 中，可很容易地观察到含有不同数量乙二 醇单元 (44 Da) 的聚乙二醇异质性。
结论 本文基于 Agilent 6520 Q-TOF LC/MS 系 统开发了一种柱后添加的 LC/MS 方法， 用以分析聚乙二醇及聚乙二醇化蛋白。柱 后添加胺类可改善质谱图质量，并且有助 于对聚乙二醇及聚乙二醇化蛋白的复杂电 荷态进行解卷积。且易于测定聚乙二醇化 蛋白的平均质量及质量分布。结果表明所 研究的聚乙二醇化治疗性蛋白和聚乙二醇 试剂本身均具有异质性。文中开发的方法 有助于在治疗性药物开发的制剂阶段对聚 乙二醇化过程进行研究。
