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技术文章
辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒
点击次数：3349 发布时间：2022/4/13 8:07:03
辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
注 意：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
测定原理：
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm下检测吸光值，从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH，从而检测NADP+含量。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
酸性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；
碱性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体15 mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支，-20 ℃保存，用时加入4mL蒸馏水，混匀；用不完的试剂4℃保存一周；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入4mL蒸馏水，混匀；用不完的试剂4℃保存一周；
试剂四：粉剂×1支，4 ℃保存，用时加入4mL蒸馏水，混匀；用不完的试剂4℃保存一周；
试剂五：液体1.8mL×1支，4 ℃保存；
试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。
NADP+和NADPH的提取：
1 血清（浆）中NADP+和NADPH的提取
NADP+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADPH的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL碱性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2组织中NADP+和NADPH的提取：
NADP+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADPH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1mL碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3 细胞或细菌中NADP+和NADPH的提取：
NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：酸性提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADPH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：碱性提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。
2、加样表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）：
试剂名称(μL)对照管测定管
样本5050
试剂一250250
试剂二7575
试剂三7575
试剂四7575
试剂五3535
试剂六500混匀，室温避光静置20min
试剂六500
充分混匀，静置5min后，20000g，25℃离心5min，弃上清，沉淀中加入：
试剂七10001000
混匀，570nm下比色，读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。
注意事项：
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若NADP+测定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH测定中△A（A2-A1）≤0.0259，说明样本中辅酶含量较
低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间20min延长到60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取0.2g样本或0.2mL样本加入1mL提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒50管测24个NADP+或NADPH。
NADP+和NADPH含量的计算：
（一）NADP+含量的计算
标准条件下的回归曲线为y = 0.197x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中y为△A，x为NADP+浓度nmol/mL
1、血清（浆）中NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 101.5×(△A -0.0144）
2、组织、细菌或细胞中NADP+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V1×Cpr)= 5.1×(△A -0.0144）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADP+ (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(W×V1÷V2)=10.2×(△A -0.0144）÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADP+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.02×(△A -0.0144）
（二）NADPH含量的计算
标准条件下的回归曲线为y = 1.2396x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中y为△A，x为NADPH浓度nmol/mL
1、血清（浆）中NADPH含量计算
NADPH含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259）
2、组织、细菌或细胞中NADPH含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259）÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）
V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
注意：低检测限为0.01nmol/mL或0.01nmol/g鲜重 或0.001nmol/mg prot
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
