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技术文章
甲型肝炎病毒 RT-PCR 检测试剂盒
点击次数：3692 发布时间：2019/8/20 8:45:42
| 产品及特点 | 甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)会引起甲型肝炎，该病毒病毒主要通过粪、口途径传播，传染源多为病人。甲型肝炎的潜伏期为 15～45 天，易感群体多为儿童及青年，发病率随年龄增长而递减，感染后临床表现多从发热、疲乏和食欲不震开始，继而出现肝肿大、压痛、肝功能损害，部份患者可出现黄疸。该病毒的感染对人体健康有较大损害，因此快速灵敏诊断具有重要意义。为此本公司开发了本产品，可用于在科研领域快速定量检测甲型肝炎病毒。它具有下列特点： 1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。 2. 根据甲型肝炎病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。 3. 灵敏度可以达到 1000 拷贝/反应。 4. 使用一管式 RT-PCR 技术，RT 和PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。 5. 本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR。 6. 本产品只能用于科研，不能用于临床。 | ||||
| 规格及成分 |
| 成份 | 编号 | 十孔盒包装 |
|
| 5×双酶一管式 RT-PCR Buffer | 91202a | 200 μL（橙盖） | |||
| MMLV-Taq Mix | 91202b | 75 μL（红盖） | |||
| 超纯水 | 100935 | 1 mL（蓝盖） | |||
| 甲型肝炎病毒 RT-PCR 引物混合液 | 13-15700yw | 100 μL（白盖） | |||
| 甲型肝炎病毒 RT-PCR 阳性对照 （1×10E8 拷贝/μL） | 13-15700pc | 50 μL（黄盖） | |||
| 天净沙核酸释放剂（试用装） | 61202a | 20 次（1mL） | |||
| 使用手册 | 13-15700sc | 1 份 | |||
| 注：为避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供甲型肝炎病 毒专一的 DNA 片段作为阳性对照。 | |||||
| 运输及保存 | 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分 开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。 | ||||
| 自备试剂 | 样品 RNA | ||||
| 使用方法 | 一、样品 RNA 的制备 1.如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 甲型肝炎病毒 PCR 阳性 对照的 10000 倍稀释的（稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万 | ||||
拷贝，可以将 10μL 原液加入到 990μL 自备TE 溶液中，充分混匀，此为 100倍稀释液。再取 10μL 此稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 10000 倍稀释液）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次天净沙核酸释放剂试用装，其使用手册可以从本公司网站搜索天净沙核酸释放剂或产品编号 61202 下载。
二、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系）
3. 如果有 N+2 个样品，则标记 N+4 个PCR 管（额外增加的两个管一个是 RT-PCR
阳性对照，另一个是 RT-PCR 阴性对照）并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：
| 成份 | N+2 个 样品管 | RT-PCR 阴性对照 | RT-PCR 阳性对照 |
| 5×双酶一管式 RT-PCR Buffer | 各 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| 甲型肝炎病毒 RT-PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 2 μL |
| N+2 个制备的样品 | 各 12.5 μL | 不加 | 不加 |
| 甲型肝炎病毒 RT-PCR 阳性对照 10000 倍稀释液 | 不加 | 不加 | 12.5 μL |
| MMLV-Taq Mix | 1.5 μL | 1.5 μL | 1.5 μL |
4. 上机进行 RT-PCR，RT-PCR 反应参数为:
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 逆转录 | 42℃ | 60 分钟 |
| 预变性 | 95℃ | 5 分钟 |
|
PCR 反应 （35 个循环） | 95℃ | 30 秒 |
| 55℃ | 30 秒 | |
| 72℃ | 30 秒 | |
| 延伸 | 72℃ | 5 分钟 |
5. 琼脂糖电泳检测扩增效果，阳性样品预期得到的扩增产物长度为 192bp。如果阴性对照有此扩增产物或阳性对照无此扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有此扩增产物、阳性对照有此扩增产物的情况下，才有必要分析样品的实验结果，如果有此扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。
| 关联产品 | 甲型肝炎病毒可视化 RT-LAMP 检测试剂盒 |
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
