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技术文章

微生物菌种的扩大培养及污染的检测与判别

点击次数：3454 发布时间：2019/4/2 13:43:43

现代工业的生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十甚至几百立方米。因此要在短时间内完成发酵，必须要有数量巨大的微生物细胞才行。种子扩大培养的任务就是要获得数量足够的健壮的微生物。种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。微生物工业自从采用纯种发酵以来，产率有了很大的提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵的经验。规范了管理措施，设计了一系列设备（例如密闭式发酵罐，培养基灭菌设备，无菌空气制备设备等）和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。但是某些发酵工业还遭受着染菌的威胁，染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐”，不但浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏。凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。因此检查的方法要求准确、快速。发酵污染可发生在各个时期。种子培养期染菌的危害最大，因严格防止。一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。发酵前期养分丰富，容易染菌，此时养分消耗不多，应将发酵液补足必要养分后迅速灭菌，并重新接种发酵。发酵中期染菌不但严重干扰生产菌株的代谢，而且会影响产物的生成，甚至使已形成的产物分解。由于发酵中期养分已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。如果是发酵后期染菌，此时产物积累已较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重，可继续进行发酵;若污染严重，可提钱放罐。染菌程度越重，危害越大;染菌少，对发酵的影响就小。所以，实际生产中，应当根据污染程度和发酵时期区别对待。

1 实验器材与试剂

1.1 器材

热空气消毒箱、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片

1.2 试剂营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、C8H9Cl、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液

1.3培养基

（1）营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉4.5g，溶于100mL蒸馏水配制，pH7.2，分装到试管中，灭菌后摆成斜面。

（2）种子培养基：葡萄糖 0.5%、磷酸二氢氨 0.1%、七水合硫酸镁 0.02%、氯化钠 0.5%、磷酸氢二钾 0.1%

（3）葡萄糖酚红肉汤培养基：C8H9Cl 0.3%、蛋白胨 0.8%、葡萄糖 0.5%、氯化钠 0.5%、 0.4% 酚红溶液，pH7.2

2实验方法

2.1种子的扩大培养

2.1.1斜面培养基的配制

配制营养琼脂培养基，分装，灭菌（121℃条件下灭菌 30min），倒斜面。

2.1.2菌种的活化

⑴将大肠杆菌采用无菌操作的方法接种于斜面上，恒温培养箱37 ℃下培养18h;

⑵培养 18h 后，观察菌落颜色是否一致，若均为黄色，挑取培养皿周边的菌落进行无菌检测;若颜色有黄有白，则两种颜色的菌落均要进行无菌检测。检测方法常用染色镜检，若检测后，没有污染，便可进行扩大培养;若检测到杂菌，要重复上述步骤，直到无菌为止，否则，不能继续下一步操作。

2.1.3扩大培养

在无菌条件下，从检测后的活化培养基上挑取10个左右菌落，用接种针接种到扩大培养基（即种子培养基）中，于37℃下振荡培16-18h，观察菌落形态。然后配合显微镜形态观察，根据结果来判断能否进行下一步。

2.2污染的检测和判别

2.2.1显微镜检查

⑴取样：用无菌操作方式取发酵液少许,涂布在载玻片上;

⑵制片、染色：自然风干后,用番红染液染色 1-2min，水洗;

⑶干燥后用油镜下观察。

2.2.2平板检查

⑴配制营养琼脂培养基，灭菌，倒平板;

⑵取少量待检发酵液经稀释（大约 10–6～10–7）后涂布在营养琼脂平板上，在电热恒温培养箱中 37℃下培养 24h;

⑶观察菌落形态。

2.2.3肉汤培养检查法（用于检测培养基灭菌是否彻底）

将1ml待测液（灭菌处理后的种子培养基）接入葡萄糖酚红肉汤培养基中，于37℃下培养24h，观察培养基的状态和颜色。

3实验结果

3.1种子的扩大培养

观察到在活化培养基上长出大量菌落，且菌落颜色单一，均为淡黄色。挑取边缘菌落及形态一致的菌落少量，制作装片，染色后在显微镜下观察，发现多个视野中都为杆菌，可初步得出活化的菌种中没有污染杂菌。挑取没有污染杂菌的菌落，用无菌操作技术接种，进行扩大培养。在适宜条件下培养 18h 后，得到了大肠杆菌的种子液，吸取该种子液在显微镜下观察到有大量的大肠杆菌。

3.2 显微镜检查

镜检时，多个视野中均观察到的均为杆菌，呈链状或单个存在，没有观察到球菌或其它形态的的细菌，因此可初步认为该种子液中没有杂菌污染。

3.3 平板检查

从营养琼脂平板培养基上观察到菌落的形态为圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明或乳白色、菌落上有小的突起，这是典型的大肠杆菌菌落，没有观察到其它形态的菌落，因此可初步认为该种子液中没有杂菌污染。

3.4 肉汤检测培养基灭菌是否彻底

葡萄糖酚红肉汤培养基中有酚红染液，酚红在酸性环境中呈黄色，碱性环境中呈红色。肉汤培养基中接种的待测液若有菌体存在，则菌体代谢会使培养基呈酸性，显示黄色。该肉汤培养基经培养后，仍呈现红色，没有变为黄色，且澄清，未浑浊，说明待测液中没有菌体存在，，因此，所测的灭菌种子培养基中没有被菌体污染。

4实验讨论

4.1 在种子的扩大培养前要对菌种进行活化培养以获得有活性的种子，若菌种已活化则可省略这一步。种子扩大培养时，如果低温保藏的菌种污染了杂菌，则应弃去或用平板培养基纯化后再用来活化和扩大培养。

4.2 采用显微镜检查法，如果从视野中发现有与目标菌株不同形态的菌体则可认为是污染了杂菌，该法简便、快速，能及时检查出杂菌。但是也有其不足之处：①对含杂菌少的样品不易得出正确的结论，故应多检查几个视野;②由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意不同生理状态下目标菌与杂菌的区别，必要时可用革兰染色、芽孢染色等辅助方法鉴别;③对固形物多的发酵液检查较困难。

4.3 采用平板检查法，若出现与目标菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染;若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与目标菌相异，则可确认污染了杂菌。此法适于固形物较多的发酵液检测，形象直观，肉眼可辨，不需仪器。但需严格执行无菌操作技术，所需时间较长，而且无法区分形态与目标菌相似的杂菌。在污染初期，目标菌占绝大部分，污染菌数量很少，所以要做比较多的平行试验才能检出污染菌。

4.4 肉汤培养检查法只能用来检测培养基的灭菌是否彻底，不适用于发酵液的检查。

4.5 可以用发酵参数判断法来检测是否有杂菌污染。即在发酵过程中，以发酵时间为横坐标，以溶解氧或排气中二氧化碳含量或发酵液的pH为纵坐标，作曲线，若在工艺不变的情况下这些特征性曲线发生变化，则很可能是污染了杂菌。但是，发酵参数判断法很难检查出早期的污染菌。

5 实验结论

本实验我们了解了种子制备的方法和发酵污染的危害，知道染菌不仅浪费大量原材料，造成严重的经济损失，而且污染了环境，所以，在种子活化培养和扩大培养中每一步均需进行无杂菌检查。显微镜直接检查法和平板间接检查法都可以用来检测杂菌污染，方法较为简便、形象直观，但是，若要进行更准确的检测，建议再做较多的平行实验。肉汤培养检查法是用于检测培养基灭菌是否彻底的有效方法。

原创作者：上海喆图科学仪器有限公司

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