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南京信帆生物：酵母实验操作方案
点击次数：3894 发布时间：2016/4/27 21:18:03
一．质粒酶切及线性化 1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。 2）线性化质粒 使用80μl酶切体系 9KSF2质粒 70μl 内切酶（SacI， SalI， BglⅡ） 2μl 10 x buffer 8μl 3）酶切3－16小时，一般3小时即可； 二．乙醇回收酶切质粒 1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA； 2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清； 3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）； 4）37℃烘干水分和残留乙醇； 5）用20μl ddH2O重溶； 6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量； 三．电转化1．准备感受态细胞 1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours； 2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5； 3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清； 4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清； 5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清； 6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；
7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。
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