如何判断竞争ELISA的标准曲线是否符合要求？

先从曲线形态入手，合格的竞争曲线是平滑向下的 S 型，存在清晰的上平台、陡峭的中间段和下平台。上平台由零标 B0 决定，不能过高也不能过低，扣除空白之后，B0 的信号要落在仪器可靠检测区间，不会紧贴仪器饱和上限，也不会和空白信号靠得太近。下平台代表最大抑制，合格体系的最大抑制要足够，一般希望能够达到百分之八十以上，如果无论多高的游离抗原都只能压下很小一部分信号，说明特异性竞争弱，这条曲线不能用。曲线中间的拐点也就是 IC50，要落在标准点序列的中部，不能靠近上平台或者下平台，不然待测样本稍微波动就很容易落到定量区间之外。

接着看拟合参数。选用反向四参数拟合时，优先看拟合优度，R 平方只是参考，不能单独作为判定依据，更重要的是各个标准点的残差，如果多个点明显偏离拟合曲线，尤其是靠近 IC50 的点残差偏大，曲线就要舍弃。斜率因子反映中间段陡峭程度，斜率太平缓意味着浓度变化带来的信号改变很小，方法灵敏度差；斜率过陡又会让有效定量窗口变得很窄，样本微小的操作误差就会造成浓度大幅漂移。如果用五参数，必须有充足标定点并且确实存在不对称，否则容易发生过拟合。

然后评估每个标准点的重复性，所有标准点都建议设置复孔。单孔之间的变异系数不能过大，高浓度抑制端和零标孔的 CV 往往更容易偏高，需要重点检查。如果出现孤立的离群点，在确认不是加样、洗涤或者污染失误之后，才可以考虑剔除，不能随意删掉对拟合不利的数据点。整条曲线要独立重复至少三次，不同批次板得到的 IC50 需要稳定，批间偏移过大说明条件没有控稳。

定量窗口和检出能力也要核验。定量区间一般定义在抑制率大约百分之二十到八十之间，也就是对应 B/B0 在零点二到零点八，这个区间内的浓度才适合用来换算样本。低于百分之二十抑制或者高于百分之八十抑制的位置，拟合不确定性很高，只可以作为定性参考，不适合定量。最低检测限可以用空白加上三倍标准差估算，要低于预期的最低待测浓度。同时要做加标回收，在空白基质里面加入已知浓度抗原，落在定量中段的回收率要落在可接受范围，以此排除严重的基质效应。

还要核对对照设置。空白孔信号应当稳定，如果空白持续走高，提示封闭不足或者试剂污染。如果使用溶剂配制高浓度标准品，还要设置溶剂对照，排除溶剂本身带来的非特异抑制。如果结构类似物已经做过交叉反应，也要保证交叉反应不会干扰当前曲线的判定。

记住几个常见的不合格情形。B0 很低，信噪比不足；达不到稳定下平台，最大抑制不够；IC50 漂移严重；大量标定点残差偏大；定量窗口过窄。只要出现这些情况，就不能直接使用这条曲线定量，需要回头调整抗体浓度、包被、封闭或者孵育平衡时间。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司