表位肽ELISA实验中，如何确定阳性对照和阴性对照？

阳性对照和阴性对照的核心作用，是帮你判断整套体系有没有正常工作，区分信号是抗体特异性识别肽表位带来的，还是板、肽、试剂本身造成的假阳性或者假阴性，表位肽 ELISA 因为短肽吸附不稳定、疏水干扰多，对照的设置比普通蛋白 ELISA 更讲究，每一类对照的意义都不一样，不能只放一个空白孔。

阳性对照的选择分两种情况，一种是体系阳性对照，用来验证实验流程、试剂、显色系统没有问题，另一种是肽特异性阳性对照，用来确认这条肽本身具备可被抗体识别的活性。体系阳性对照优先选用已知可以稳定识别该表位肽的纯化抗体或者阳性血清，提前验证过，在这个肽上能得到高信噪比的信号。如果是重叠肽库 mapping 筛选，也可以拿已经确认阳性的那条肽作为肽阳性对照，放在每一块板上，用来监控板间差异。阳性对照的信号要求是 OD 落在合适区间，信噪比达标，一旦阳性对照不出信号，整板结果都不可信，要排查包被、一抗二抗、底物或者洗涤的问题。要注意阳性对照抗体不能和封闭蛋白、载体蛋白发生反应，如果肽是偶联 KLH 的，阳性抗体应当是针对肽段本身，而不是针对 KLH 的抗体。

阴性对照分为好几个层级，各自排除的干扰不一样，不能互相替代。首先是载体对照，包被同等摩尔或者同等质量的 KLH 或者 BSA，不加肽，这个对照用来区分抗体识别的是肽序列，还是偶联载体蛋白，很多免疫血清里有大量抗载体的抗体，只看肽孔阳性很容易误判。其次是无关肽对照，选用长度接近、理化性质相近但没有同源表位的多肽，用和待测肽完全一样的包被浓度包被，它用来排除因为肽疏水、电荷带来的非特异性疏水吸附，这个对照在表位肽实验里尤其重要，很多疏水肽哪怕没有特异性表位，也会吸附抗体产生偏高的 OD。然后是空白对照，孔里只加包被缓冲液，不加任何肽，后续封闭、一抗二抗步骤和其他孔完全一致，用来评估板本身、封闭液、二抗的本底。还有样本阴性对照，就是不含目标特异性抗体的样本，比如免疫前血清、正常小鼠血清、杂交瘤阴性上清，用和待测样本一样的稀释比例稀释，用来判断样本本身自带的背景。

判断标准上，阳性对照需要稳定出现明显高于所有阴性对照的信号，阴性对照的 OD 应当维持在较低水平，一般优先看无关肽对照和载体对照，而不是只看空白。cutoff 值可以基于阴性对照的均值加上几倍标准差计算，高于这个阈值才判定为阳性。如果载体对照高，说明抗体识别载体；如果无关肽对照高，说明是肽理化性质带来的非特异吸附，不是序列特异性结合。

做肽库筛选的时候，每一块板上都要带上全套对照，而不是只在块板设置。如果更换肽、抗体、封闭液、载体类型，对照的组合也要跟着调整。另外要避免对照设置上的常见误区，不要拿无关重组蛋白替代无关肽，二者理化性质差异大，没法很好模拟短肽的非特异吸附；也不要只用空白对照就判定结果，载体和无关肽的干扰是表位肽 ELISA 最常见的假阳性来源。如果阳性对照信号弱，说明体系有问题，不能强行解读待测肽的结果；如果阴性对照普遍偏高，不能直接判定所有肽都是阳性，要先回头优化封闭、洗涤、肽包被条件。

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