表位肽ELISA实验中，如何确定肽包被浓度？

肽包被浓度是表位肽 ELISA 里很关键的变量，因为短肽分子量小、被动吸附能力差异很大，过高或者过低都会影响最终信噪比，不能直接套用重组蛋白的包被浓度，需要在固定其他条件的前提下做预实验摸索。

首先要固定其余所有环节，封闭液、封闭条件、一抗稀释度、二抗体系、显色条件全部不变，只改变肽的包被浓度，同时每一个浓度都配套阳性肽、无关肽、载体对照，保证能区分特异性结合和非特异吸附。

常用的摸索梯度可以从低到高设置，一般从零点五微克每毫升开始，依次设置一微克每毫升、二微克每毫升、五微克每毫升、十微克每毫升、二十微克每毫升。溶解度差、疏水性强的肽不要直接冲到很高浓度，容易析出沉淀，反而造成背景飙升。如果是经过 KLH 或者 BSA 偶联后的肽，梯度要适当下调，因为载体蛋白本身会占据板上吸附位点，过高浓度容易发生竞争吸附。

判断的核心依旧是信噪比，而不是阳性孔 OD 越高越好。包被浓度偏低的时候，固相上结合的肽量不足，阳性信号弱，和背景区分不开；随着浓度升高，阳性信号逐步上升，信噪比持续增加。当浓度超过合适区间之后，板上吸附位点饱和，再多的肽也无法固定，游离的肽残留在孔内，或者多层肽堆叠，暴露更多疏水区域，无关肽孔、载体对照的非特异吸附同步上升，信噪比反而下降。这个信噪比最高点对应的浓度，就是合适的包被浓度。同时还要兼顾阳性 OD 落在零点八到二点零这个合适区间，避免过早进入平台饱和。

有几种表位肽独有的情况需要留意。一部分肽即使提高浓度，吸附量提升也很有限，这类肽单纯被动包被很难拿到好信号，就需要考虑 N 端或者 C 端引入半胱氨酸，定向偶联到载体或者活化板上，而不是继续盲目提高包被浓度。还有一部分亲水肽，高浓度下容易从板上解离，后续孵育洗涤步骤中流失，阳性信号反而下降。DMSO 助溶的肽，要控制加入包被液后的终浓度，一般不超过百分之一，浓度太高会破坏聚苯乙烯板的吸附能力，造成肽脱落。

预实验评估的时候还要看复孔的重复性，同一个浓度下复孔变异系数如果偏大，往往说明这个浓度下肽吸附不稳定，即使信噪比尚可，也不适合作为正式实验的浓度。如果是重叠肽库批量 mapping，优先选择一个兼顾多数肽的折中浓度，而不是单独为某一条肽优化，保证所有肽之间结果可以横向对比。

换新批次多肽、换不同品牌酶标板、从游离肽改成偶联肽包被，都需要重新做包被浓度的预实验。另外包被缓冲液统一用 pH 九点六的碳酸盐缓冲液，这个环境适合多肽被动吸附，缓冲体系变动也会改变肽的吸附效率，摸索浓度时缓冲液不能随意更换。

如果预实验发现随着包被浓度升高，阳性信号几乎不上升，同时背景持续走高，优先怀疑肽本身疏水、聚集或者溶解度不足，而不是继续上调包被浓度。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司