如何进行间接 ELISA 的棋盘滴定实验？

间接 ELISA 棋盘滴定，核心就是只变动包被抗原和一抗这两个条件，其余所有试剂、孵育和洗板流程全部固定，用来筛选二者配对。

先准备好所有试剂，高结合力酶标板，包被用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液，洗涤液是含 0.05% 吐温的 PBS，封闭液选定一种不再更换，抗体稀释液统一，二抗先固定一个经验稀释比例，底物和终止液提前备好。

梯度设置上，横向也就是不同列设置包被抗原梯度，常用 0.25、0.5、1、2、4 微克每毫升，同时预留一列只加包被液不加抗原作为空白包被对照。纵向也就是不同行设置一抗稀释梯度，常用 1 比 500、1 比 1000、1 比 2000、1 比 4000、1 比 8000，额外设置一行阴性对照，阴性对照使用和阳性抗体相同稀释基质的阴性血清或者稀释液。每个交叉组合尽量设置复孔，减少随机误差。

操作步是包被抗原，每孔加入一百微升配好的抗原，按照列区分不同浓度，空白包被列只加缓冲液。封板之后优先四度过夜，也可以选择三十七度两小时。包被结束倒掉液体，PBST 洗板三次，每次浸泡半分钟到一分钟，拍干，不要让孔干透。

第二步封闭，每孔加入两百微升封闭液，三十七度孵育一小时，也可以四度过夜。封闭完成后倒掉液体，可以直接进入下一步，或者轻柔洗一次板。

第三步加一抗，按照行依次加入梯度稀释的阳性抗体，阴性行加入阴性对照。封板三十七度孵育一小时，孵育结束弃去液体，PBST 洗板四次，充分拍干。

第四步加酶标二抗，整块板子使用同一个固定稀释度的二抗，每孔一百微升，三十七度孵育四十到六十分钟，之后再次洗板四次并拍干。

第五步显色终止读板，每孔加入一百微升 TMB 底物，室温避光统一显色，整块板子同步终止，不能单独停止个别孔。加入终止液之后，在 450 纳米波长读取 OD 值。

拿到读数之后，先计算每组复孔的平均 OD，用同行同列的阴性均值计算 P/N 值。筛选的时候优先选择 P/N 最大的组合，理想状态下阳性 OD 落在 1.5 到 2.5 之间，阴性 OD 低于 0.1。需要避开 OD 超过 3.0 的饱和区域，也不要选用信号低于 0.8 的组合。同时观察信号上升趋势，优先选择抗原刚接近平台拐点的浓度，不要选择完全饱和的高浓度抗原，一抗也要处于亚饱和状态，保证信号可以随抗体浓度形成梯度变化，复孔的变异系数尽量控制在百分之十以内。

棋盘得到候选配对之后，不能直接当作正式实验条件，还需要用系列稀释的标准抗体做标准曲线，验证线性、检出限、梯度区分度和重复性。

实验里需要注意，棋盘阶段不能改动二抗、封闭液、孵育时长这类条件，避免变量过多无法分析；显色时间必须整块板保持一致；阴性对照的稀释体系要和阳性抗体完全一致。如果板子数量有限，可以缩减梯度，抗原设置 0.5、1、2 微克每毫升，一抗设置 1 比 1000、1 比 2000、1 比 4000，做三乘三的简易棋盘快速预筛。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司