ELISA实验中TMB的缓冲液配方是怎样的？

TMB 显色反应的最佳 pH 为4.8～5.2，常用pH5.0 0.05 M 磷酸 - 柠檬酸缓冲液，这是实验室自制 TMB 底物的基础缓冲液Sigma-Aldr...。

1. 母液配制

0.2 M Na₂HPO₄（磷酸氢二钠）：28.4 g/L

0.1 M 柠檬酸：19.2 g/L

2. pH5.0 磷酸 - 柠檬酸底物缓冲液（100 mL）

0.2 M Na₂HPO₄：25.7 mL

0.1 M 柠檬酸：24.3 mL

超纯水：50 mL
混匀，用 pH 计微调至 pH 5.0，4℃避光保存。

原理：HRP 在弱酸性条件下催化 H₂O₂氧化 TMB 活性；pH 过高显色慢、灵敏度下降；pH 过低背景升高。

3. TMB 显色工作液（临用前现配！）

TMB 母液：TMB 粉末溶于 DMSO，配成 10 mg/mL（避光，-20℃保存）

取pH5.0 磷酸 - 柠檬酸缓冲液 10 mL

加入 TMB 母液 0.5 mL（终浓度 0.5 mg/mL）

加入 30% H₂O₂ 10 μL（终浓度约 0.03%）
混匀，避光，立即使用。

每孔加 100 μL TMB 工作液，室温避光显色。

备选：醋酸 - 柠檬酸缓冲液（部分商品化试剂盒使用，pH4.9）

醋酸钠 + 柠檬酸体系，pH4.9，稳定性较好，配方：
醋酸钠 13.6 g，柠檬酸 1.6 g，加水定容至 500 mL，调 pH 至 4.9，用于 TMB 底物 B 缓冲液。

4. 终止液配方（配套 TMB）

2 M H₂SO₄：取浓硫酸 11.1 mL，缓慢加入 88.9 mL 超纯水，冷却后使用。
加酸后蓝色→黄色，450nm 读板。

5. 关键注意事项

H₂O₂必须临用添加，提前加入会造成 TMB 自发氧化，空白孔 OD 飙升。双组分商品化试剂盒就是把 TMB 和 H₂O₂分开，避免提前氧化。

金属离子（Fe、Cu）会催化 TMB 自发氧化，全部使用超纯水，容器尽量塑料。

TMB 母液 DMSO 配制，避光保存；如果 TMB 工作液配制后立刻变蓝，直接丢弃。

缓冲液可以提前配好 4℃保存；显色工作液不能长期存放，现配现用。

不要加叠氮钠！叠氮钠会抑制 HRP。

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TMB 显色底物缓冲液采用 0.05 mol/L 磷酸 - 柠檬酸缓冲液，pH 5.0。临用前将 TMB 母液与缓冲液混合，加入新鲜过氧化氢配制显色工作液，避光使用；采用 2 mol/L 硫酸作为终止液，450 nm 读取吸光度。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司