BCA法测定蛋白的问题排查

原理回顾，碱性环境下蛋白质可以将二价铜离子还原成一价铜离子，BCA 试剂和一价铜离子结合生成紫色复合物，在 562nm 进行比色测定；该方法容易受到还原剂、螯合剂以及高浓度去污剂的干扰。

标准曲线相关问题

标准曲线线性差，R² 数值偏低。首先考虑 BSA 标准品反复冻融发生降解，BSA 母液建议分装冻存，避免反复冻融。配制标准梯度点的时候低体积点位容易引入移液误差，低浓度点尽量采用更大的稀释体积来减少移液带来的偏差。标准梯度稀释之后没有充分吹打混匀，加入 BCA 工作液之后孔内混匀不足也会破坏线性。还要核对工作液配比，A 液与 B 液正常配比是 50 比 1，观察 B 液是否出现沉淀或者颜色改变提示试剂失效。孵育的温度波动以及 96 孔板的边缘蒸发效应同样会造成线性变差。排查的时候首先确认 A 液澄清，B 液硫酸铜为正常蓝色无沉淀，现配新鲜的 BCA 工作液。BSA 工作梯度现稀释现用，母液分装放置于负二十摄氏度保存。孵育条件保持整批板子完全统一，不要放在温度波动大的烘箱当中。

标准曲线整体吸光度全部偏低，所有点位 OD562 读数都比较低。有可能是配制工作液的时候 B 液添加量不足，孵育时间不足或者孵育温度偏低造成显色不完全，可以适度延长孵育时间或者小幅提高孵育温度。也有可能整套 BCA 试剂已经失效，硫酸铜组分变质；或是 BSA 母液本身浓度就存在错误，稀释之后标准品实际浓度偏低。

空白孔吸光度偏高，空白本底数值偏大。空白对照不可以直接使用纯水，空白应当使用和待测样本完全一样的裂解缓冲液，这是最常见的出错点。BCA 工作液配制完成之后放置过久也会造成本底升高，工作液尽量做到现配现用。96 孔板本身存在污染，孔板外壁残留洗涤剂、指纹水渍，读板前底部没有擦拭干净同样抬高空白读数。裂解缓冲液里面高浓度 EDTA 这类螯合剂可以螯合铜离子，也会带来空白升高的现象。

样本孔 OD 异常问题

样本读数低于空白，出现负值。裂解体系当中含有较高浓度 DTT 或者 β‑巯基乙醇、TCEP 这类强还原剂会消耗铜离子，直接抑制 BCA 显色，最终样本显色弱甚至读数低于空白。含有高浓度还原剂的 RIPA 裂解液不适合直接用于 BCA 测定。也有可能样本本身蛋白浓度极低接近仪器本底，再加上缓冲液自带微弱本底，就会出现负值。加样之后孔内残留气泡，没有去除气泡就读数，气泡也会压低吸光度结果。

样本显色很深，读数超过标准曲线最高点，超出线性范围。代表样本蛋白浓度过高，BCA 正常线性区间大致在 0.2‑2mg 每毫升。需要使用相同的裂解缓冲液对样本做梯度稀释之后重新测定，稀释的时候不要更换溶剂，不建议直接用水稀释蛋白样本，稀释之后记得同步设置对应稀释缓冲液的空白对照。

同一份样本设置的复孔之间读数差异很大，重复性差。加完样本再加入 BCA 工作液之后没有充分震荡混匀，96 孔板封板之后应当放置摇板机震荡三十秒到一分钟。蛋白裂解结束之后样本没有离心取上清，裂解体系当中残留不溶性沉淀，上样之前样本没有充分混匀，每次吸取的时候取到沉淀就会造成复孔偏差。定量之前建议一万两千 g 离心五分钟，只吸取上清进行 BCA 测定，上样前充分吹打混匀蛋白上清。孵育阶段边缘孔溶剂发生蒸发，也会造成结果偏移，尽量优先使用板子中间的孔位，边缘位置可以补充纯水减少蒸发。同时也要确认移液枪经过校准，吸液的时候液滴不要挂在孔壁上方，保证液体全部落入孔内液面。

裂解液组分干扰情况

高浓度 DTT 以及 β‑巯基乙醇会抑制显色，造成吸光度整体下降。遇到这类干扰优先更换不含还原剂的裂解体系；也可以后续通过 TCA‑丙酮沉淀去除小分子干扰物之后重新溶解蛋白再定量；也可以更换 Bradford 考马斯亮蓝定量方法。EDTA 浓度超过 1 毫摩尔每升之后会螯合铜离子抑制显色，可以尽量降低裂解缓冲液内 EDTA 的浓度，或者蛋白沉淀之后重溶。BCA 对 SDS 存在一定耐受，一般百分之零点一到百分之一的 SDS 影响不大，去污剂浓度进一步升高之后干扰会逐步显现。Triton X‑100 以及 NP‑40 这类非离子去污剂中等浓度可以耐受，浓度超过百分之二容易出现体系浑浊沉淀，一般通过样本稀释就可以缓解。尿素四摩尔每升以内干扰较小，更高尿素浓度建议先做稀释处理。

孵育条件的注意要点

三十七摄氏度孵育三十分钟，显色速度平缓，整体重复性表现更好，适合绝大多数样本，缺点是信号强度相对偏弱。六十摄氏度孵育十五到二十分钟显色更强，可以提升检测灵敏度，但是孵育时间必须严格把控，孵育过久空白会自发升高，标准曲线线性被破坏。孵育结束之后板子需要冷却至室温再上机读数，热板子直接测定，温度会带来吸光度漂移，同一批样本冷却的时间必须保持统一。孵育不需要严格避光，但是长时间光照放置会缓慢抬升空白，尽量不要强光长时间放置板子。

完整实操排查思路

步优先核查空白孔，确认空白使用和样本一致的裂解缓冲液加上 BCA 工作液，不要直接用水设置空白。第二步重新配制新鲜 BCA 工作液，现稀释 BSA 标准梯度，重新跑标准曲线确认 R² 合格，先排除试剂本身的问题。第三步确认蛋白样本经过离心去除不溶性沉淀，加样之后充分震荡混匀，消除孔内气泡之后再进行读数。第四步核对裂解缓冲液配方，排查还原剂、高浓度螯合剂、高浓度去污剂带来的干扰。第五步做稀释验证，同一份样本做两倍以及五倍梯度稀释，如果回算得到的蛋白浓度明显上升，就提示原始裂解体系当中存在组分抑制 BCA 显色。如果小分子干扰很难消除，可以采用 TCA‑丙酮沉淀的办法，去除上清当中干扰小分子。样本加入 TCA 至终浓度百分之十，负二十摄氏度放置三十分钟，离心收集蛋白沉淀，预冷丙酮洗涤沉淀两次，沉淀适度晾干之后选用合适缓冲液重新溶解蛋白，再进行 BCA 定量。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司