除了移液器系统误差和体系分配与加样误差，还有哪些原因会导致PCR结果差异显著？

排除加样 / 移液误差后，同管分装 PCR 条带强弱差异其余原因

1. PCR 管贴合与导热不一致

同一批管子管壁厚薄、管底平整度存在微小差别，放入加热模块后，有的管底完全贴紧金属槽，有的悬空微翘。

受热不均直接导致变性、退火、延伸实际温度不一样，扩增效率出现明显差距，越是长片段、高 GC 基因越明显。

另外管盖松紧程度不同，热盖密封效果有差异，管内微量蒸发程度不同，体系浓度被动改变，亮度自然不一样。

2. 仪器模块孔位温度偏差

不是操作问题，是仪器硬件本身：PCR 加热块孔与孔之间存在固有温差，普遍 0.5~2℃。

放在中间孔扩增稳定，靠边、四角孔温度偏低，酶促反应速率变慢，产物变少条带偏弱。

同一排不同孔位依旧会出现强弱分化，完全一样的体系也出不一样结果。

3. 管壁吸附造成模板 / 酶损耗

核酸、Taq 酶容易吸附在PCR 管内壁，静置时间越长吸附越多。

分装完毕后，两支管子静置摆放位置不同、静置时长不同，吸附量不一样，实际参与扩增的有效模板与酶量不等，扩增产量差距拉大。

4. 离心程度不一致

分装后两支管子离心力度、时间、摆放角度不同。

液体有的完全沉底，有的挂壁残留试剂与模板，反应体系实际混合程度不同，起始扩增效率出现区别，循环越多差异被放大。

5. 体系内气泡影响扩增

分装过程中产生微小气泡，两支管子气泡数量、位置不一样。

气泡区域导热差，局部温度异常，还会分隔反应液，造成局部底物浓度不均，抑制正常扩增，出现一亮一弱。

6. 模板自身局部分布不均

哪怕提前混匀模板，静置后核酸依然会轻微沉降。

先后分装取液时，一管偏向上层稀液、一管偏向底层浓液，模板起始浓度隐性不等，最终产物亮度差异极大。

7. 酶活性微环境差异

Taq 酶对离子浓度、微量杂质极度敏感。

分装后两支管子所处环境温差、光照、摆放位置不同，短时间内酶活性出现细微波动，经过几十个循环指数扩增，差异肉眼清晰可见。

8. 扩增结束后产物降解速度不同

PCR 跑完取出顺序不同，一支先放室温、一支留在仪器内保温。

长时间高温静置，部分片段先出现降解，电泳时条带明显变弱，并非扩增阶段差异，是后处理时效差异。

9. 电泳上样与成像判读误差

扩增产物本身浓度一致，但点样时沉降不均、吸样深浅不同，加上凝胶厚薄、染色吸附、紫外曝光时间微调，直接拍出一亮一暗，属于视觉结果差，不是 PCR 扩增差异。

10. 引物二聚体与非特异扩增互相抢占底物

两支管子内部微观离子分布细微差别，导致引物二聚体形成量不一样。

二聚体越多，消耗引物与 dNTP 越多，目的条带扩增被挤占，亮度明显偏低。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司