毕赤酵母蛋白表达的实验步骤

毕赤酵母（Pichia pastoris）蛋白表达完整实验步骤

主流体系：AOX1 启动子甲醇诱导型（表达量高、调控严谨），以分泌型表达（最常用）为核心，胞内表达仅在关键步骤标注差异。

核心流程：重组质粒构建与线性化→电转感受态制备→电转化→阳性克隆筛选与鉴定→小量试表达与条件优化→大量诱导表达→蛋白收集与初步处理

一、重组表达质粒构建与线性化（决定整合效率与表达量）

1. 载体与菌株选择

分泌型表达优先选用 pPICZαA/B/C 或 pPIC9K，均带有 α-factor 信号肽可引导蛋白分泌至胞外，同时含 AOX1 启动子和 His 标签，能大幅简化后续纯化步骤并减少胞内蛋白酶对目的蛋白的降解。胞内表达可选 pPIC3.5K 或 pPICZA，不含信号肽，适合分泌困难或对信号肽敏感的蛋白。若目的蛋白对甲醇敏感，可选用组成型载体 pGAPZαA，其使用 GAP 启动子，无需甲醇诱导即可实现连续培养表达。

常用宿主菌株包括 GS115，为 His⁻、Mut⁺野生型，是最通用的表达菌株；SMD1168 为 His⁻、pep4⁻prb1⁻蛋白酶缺陷型，能显著解决蛋白降解问题；KM71 为 His⁻、Mutˢ型，甲醇利用速度较慢。

2. 质粒构建

将目的基因克隆至载体的多克隆位点，若使用 C 端标签，需注意避免引入额外的终止密码子。克隆完成后必须测序验证，确保目的基因序列正确、读码框无误，且启动子和终止子元件完整。随后进行无内毒素质粒大提，要求质粒浓度≥1μg/μL，A260/A280 比值在 1.8-1.9 之间。

3. 质粒线性化（绝对关键，未线性化几乎无有效转化）

线性化位点的选择决定了质粒的整合方式和转化子的 Mut 表型。推荐采用单交换整合，该方式获得高拷贝整合克隆的概率更高，其中 pPICZαA 用 SacI 酶切，pPIC9K 用 SalI 或 SacI 酶切，整合至 AOX1 位点后会保留内源 AOX1 基因，转化子表型为 Mut⁺。若采用双交换整合，需用 BglII 酶切，会敲除内源 AOX1 基因，转化子表型为 Mutˢ。

酶切体系通常取 50-100μg 质粒，加入对应限制性内切酶，37℃酶切 3-4 小时。酶切完成后需取少量样品跑胶验证线性化是否完全，确保无超螺旋质粒残留。随后通过酚 - 抽提加乙醇沉淀，或使用 DNA 纯化试剂盒回收线性化质粒，最终用无菌 ddH₂O 洗脱，调整浓度至≥0.5μg/μL，-20℃保存备用。

二、毕赤酵母电转感受态细胞制备

从 YPD 平板挑取直径 2-3mm 的新鲜单克隆，接种至 5mL YPD 液体培养基，30℃、250rpm 摇培过夜。次日按 1% 接种量转接到 100mL YPD 培养基中，继续在相同条件下摇培至 OD₆₀₀=1.3-1.5，此时细胞处于对数中期，感受态效率最高。

将菌液冰浴 30 分钟，4℃、4000g 离心 5 分钟收集菌体，弃尽上清。用预冷的无菌 ddH₂O 重悬菌体，相同条件离心洗涤，重复 2 次。再用预冷的 1M 无菌山梨醇重悬菌体，离心后弃上清。最终用 1mL 预冷的 1M 无菌山梨醇轻轻重悬菌体，分装为 80μL / 管。感受态细胞现制现用效率最高，若需保存，可经液氮速冻后置于 - 80℃，但需在 1 个月内使用，超过期限转化效率会下降约 50%。

三、电转化

取 80μL 新鲜制备或解冻的感受态细胞，加入 5-10μg 线性化质粒，轻轻混匀后冰浴 10 分钟。将混合液转移至预冷的 0.2cm 电转杯中，轻敲杯壁使液体沉底，用吸水纸擦干电转杯外壁的水分。

使用 Bio-Rad 电转仪，设置参数为电压 1500V，电容 25μF，电阻 200Ω，正常放电时间常数应在 5-10ms 之间。电击完成后立即加入 1mL 预冷的 1M 无菌山梨醇，轻轻吹打混匀，转移至 1.5mL 离心管中。30℃静置复苏 1 小时，此过程切勿摇晃，避免细胞破裂。

取 100-200μL 复苏后的菌液，涂布于 MD 筛选平板（组氨酸缺陷型，用于筛选 His⁺转化子），30℃倒置培养 2-3 天，直至单克隆长出。

四、阳性克隆筛选与鉴定

1. 初筛：高拷贝克隆筛选（仅适用于含 Kan 抗性的载体）

配制含不同浓度 G418 的 YPD 平板，浓度梯度依次为 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL。用无菌牙签挑取 MD 平板上的单克隆，依次点种于不同浓度的 G418 平板上，30℃培养 2-3 天。能在高浓度 G418（≥1mg/mL）平板上生长的克隆，大概率为高拷贝整合克隆，其目的蛋白表达量通常更高，优先用于后续表达实验。

2. 分子鉴定（PCR 法，验证目的基因整合与 Mut 表型）

挑取初筛得到的候选单克隆，接种至 5mL YPD 培养基，30℃摇培过夜。取 1mL 菌液，采用煮沸法快速提取基因组 DNA：12000rpm 离心 1 分钟弃上清，加入 50μL ddH₂O 重悬菌体，煮沸 10 分钟后立即冰浴 5 分钟，12000rpm 离心 5 分钟，取上清作为 PCR 模板。

PCR 使用 AOX1 通用引物，上游引物为 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，下游引物为 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。结果判断如下：仅扩增出约 2.2kb 条带的为空载体转化子，为阴性；同时扩增出约 2.2kb 条带和目的基因条带的为 Mut⁺阳性克隆；仅扩增出目的基因条带的为 Mutˢ阳性克隆，说明内源 AOX1 基因已被敲除。

五、小量试表达与条件优化（决定最终表达成败的核心步骤）

不同蛋白的最佳表达条件差异极大，必须进行小试优化，同时需设置空载体转化子作为阴性对照，排除背景干扰。

1. 标准诱导流程

挑取 PCR 验证阳性的单克隆，接种至 5mL BMGY 培养基，30℃、250rpm 摇培至 OD₆₀₀=2-6，此时细胞处于对数生长期。室温下 3000g 离心 5 分钟收集菌体，弃尽上清，用 BMMY 培养基重悬菌体至 OD₆₀₀=1.0，转移至 50mL 摇瓶中，注意装液量不得超过摇瓶体积的 1/5，以保证充足的溶氧。

30℃、250-300rpm 摇培诱导，每 24 小时补加一次甲醇至对应终浓度。分别在诱导 24、48、72、96 小时取样 1mL，12000rpm 离心 5 分钟，分泌型表达取上清保存，胞内表达取菌体沉淀保存，所有样品均置于 - 20℃备用。

2. 关键条件优化（按优先级排序）

首先优化甲醇终浓度，Mut⁺菌株的优化范围为 0.5%-1.5%，常用终浓度为 1%；Mutˢ菌株的优化范围为 0.25%-0.5%。甲醇浓度过高会导致细胞中毒死亡，过低则诱导不足，无法启动目的基因的高效表达。

其次优化诱导温度，绝大多数蛋白在 20-25℃低温下表达，可显著减少蛋白酶的降解作用，提高目的蛋白的可溶性。若 30℃下表达出现严重降解或包涵体过多，应优先尝试降低温度。

诱导时间的优化范围为 24-96 小时，分泌型表达一般在 48-72 小时达到表达峰值，胞内表达可适当延长至 96 小时。需通过不同时间点的取样检测，确定目的蛋白的最佳收获时间。

培养基 pH 可在 3.0-7.0 范围内优化，毕赤酵母在此 pH 区间内均可正常生长，应根据目的蛋白的稳定性调整培养基 pH，避免目的蛋白在不适宜的 pH 条件下变性或降解。

溶氧是影响毕赤酵母表达量的关键因素之一，毕赤酵母为严格好氧菌，溶氧不足会导致表达量骤降。除控制摇瓶装液量外，还可适当提高摇床转速至 300rpm 以上，或在培养基中加入少量消泡剂，改善通气条件。

3. 表达检测

首行 SDS-PAGE 初步检测，采用考马斯亮蓝染色，对比阴性对照样品，观察是否有预期大小的目的条带。若条带不明显或存在非特异性条带，需进一步进行 Western Blot 确证，使用抗 His 标签抗体或目的蛋白特异性抗体进行检测。

六、大量诱导表达

按照小试确定的最佳条件进行放大培养。先将 5mL 种子液转接到 500mL BMGY 培养基中（使用 2L 摇瓶），30℃摇培至 OD₆₀₀=2-6。离心收集菌体，用 BMMY 培养基重悬至 OD₆₀₀=1.0，分装至多个 2L 摇瓶中，每瓶装液量严格控制在 100-200mL 之间。

在小试优化的温度和转速下诱导培养，每 24 小时准确补加一次甲醇至最佳终浓度。诱导结束后，4℃、8000g 离心 10 分钟：分泌型表达收集上清，立即加入蛋白酶抑制剂（如 PMSF、EDTA 等），4℃保存或直接进行纯化；胞内表达收集菌体沉淀，用预冷 PBS 洗涤 2 次，-80℃冻存备用。

七、蛋白初步处理与纯化前准备

1. 分泌型蛋白

先将收集的上清在 4℃、12000g 离心 30 分钟，去除细胞碎片。然后使用超滤管进行浓缩和换液，超滤管的截留分子量应选择目的蛋白分子量的 1/3 左右。将上清浓缩至合适体积后，换至纯化缓冲液中，如 20mM Tris-HCl（pH8.0）。预处理完成后即可进行 Ni-NTA 亲和层析纯化，若需更高纯度的蛋白，可后续进行离子交换层析或凝胶过滤层析进一步纯化。

2. 胞内型蛋白

将冻存的菌体用预冷的裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）重悬，置于冰浴中进行超声破碎。超声参数设置为功率 300W，工作 3 秒，间隔 5 秒，总超声时间约 30 分钟，直至菌液变得澄清透明。4℃、12000g 离心 30 分钟，分离上清和沉淀，上清中为可溶性目的蛋白，可直接进行纯化；沉淀中为包涵体形式的目的蛋白，需先经变性、复性处理后再进行纯化。

八、关键注意事项（避坑指南）

质粒线性化必须完全，酶切后一定要跑胶验证，若存在超螺旋质粒残留，会导致转化效率大幅降低且假阳性增多。

电转全程需保持低温，所有试剂、耗材、离心管和电转杯均需提前预冷，感受态细胞避免在室温下长时间放置。

甲醇需使用色谱纯级别，避光保存，补加时要准确计算体积，避免培养基中甲醇浓度出现大幅波动。

若出现目的蛋白严重降解问题，可优先使用蛋白酶缺陷型菌株 SMD1168，同时降低诱导温度、缩短诱导时间，并在所有操作步骤中全程加入蛋白酶抑制剂。

毕赤酵母生长速度较慢，易被细菌污染，所有操作必须严格遵守无菌规范，培养基需高压灭菌。

标签选择优先使用 C 端 His 标签，N 端标签可能会影响 α-factor 信号肽的切割效率，进而影响蛋白的分泌和表达量。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司