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GENMED细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒
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更新日期：2026/8/7 16:44:46
生 产 地：中国大陆
产品型号：
商家名片
王**
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相关标签：GENMED细胞CDK4/CYCLIN,D激酶活性光谱法定量检测试剂盒
详细内容
GENMED细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
GENMED细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成多肽底物，在CDK6/CYCLIN D激酶抑制剂的存在下，受到CDK4/CYCLIN D磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中CDK4/CYCLIN D特异活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中CDK4/CYCLIN D激酶的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
GENMED细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒技术背景
细胞周期素依赖性激酶4（cyclin dependent kinase 4；CDK4；EC 2.7.11.22），又称为皮肤恶性黑色素瘤因子3（cutaneous malignant melanoma 3；CMM3），属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其与酵母细胞的cdc28和cdc2高度进化保留。细胞周期素依赖性激酶4的催化亚体，在细胞周期素D和p16的调节下，在细胞周期G1-S期作用，允许细胞通过G1期，达到调节细胞生长、DNA复制、细胞分裂等。P16INK4a 是CDK4激酶的抑制剂。成视网膜细胞瘤（retinoblastoma；Rb）基因产物是CDK4激酶的磷酸化目标蛋白。细胞周期素依赖性激酶4异常将导致恶性肿瘤等。CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化目标序列为RPPTLSPIPHIPR。基于底物RPPTLSPIPHIPR，在ATP和CDK6/CYCLIN D抑制剂Ro 318220的存在下，受到CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析细胞周期素依赖性激酶4/细胞周期素D的特异活性。其反应方式为：
GENMED细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品内容
GENMED清理液（Reagent A） 毫升
GENMED裂解液（Reagent B） 毫升
GENMED缓冲液（Reagent C） 毫升
GENMED酶促液（Reagent D） 微升
GENMED反应液（Reagent E） 微升
GENMED底物液（Reagent F） 微升
GENMED阴性液（Reagent G） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存GENMED清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
CDK4/CYCLIN D激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
比色皿或酶标板：用于光谱分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光谱分析
实验步骤
一、待测样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2．小心加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5．加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升GENMED裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
三、背景对照测定
1．移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升GENMED反应液（Reagent E）
4．加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入xx微升GENMED阴性液（Reagent G）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
四、样品测定
1．移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升GENMED反应液（Reagent E）
4．加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
五、计算样品活性
六、酶标板测定
1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到96孔板中
3．分别加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
4．分别加入xx微升GENMED反应液（Reagent E）
5．分别加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
6．轻轻摇动96孔酶标板
7．在30℃温度下孵育3分钟
8．分别加入xx微升GENMED阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
9．轻轻摇动酶标板
10．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11．活性计算：
七、抑制剂筛选
1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2．按下表加入试剂，进行样品预处理
内容物空背景对照样本背景完全酶活性待测抑制剂酶活性
GENMED缓冲液（Reagent C）xx微升xx微升xx微升xx微升
GENMED阴性液（Reagent G）xx微升xx微升xx微升——
待测抑制剂——xx微升――xx微升
用户自备的纯化酶————xx微升（1毫单位）xx微升（1毫单位）
96孔板每孔总量空背景对照孔
（xx微升）样本背景孔
（xx微升）完全活性孔
（xx微升）待测抑制剂样品孔
（xx微升）
轻轻摇动酶标板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作
3．分别移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4．分别加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
5．分别加入xx微升GENMED反应液（Reagent E）
6．分别加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
7．轻轻摇动酶标板
8．在30℃温度下孵育3分钟
9．加入20微升上述预处理的待测样品
10．即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
11．抑制活性计算：
注意事项
1．本产品为25次操作，包括背景操作
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5．样品须澄清，至关重要
6．加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
7．测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
8．光谱测定后，比色皿须清洗彻底
9．样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．可以使用CDK4/CYCLIN D抑制剂二氨基氧吖啶氢硫酮【1,4-Dimethoxyacridine-9(10H)-thione）；IC50＝200纳摩尔】或Arcyriaflavin A（IC50=59纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
13．CDK4/CYCLIN D激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
14．本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
单组分订购信息
编号名称规格
GMS50149.1.3GENMED细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒20次
GMS50149.1.3AGENMED清理液（Reagent A） 500毫升
GMS50149.1.3BGENMED裂解液（Reagent B） 100毫升
GMS50149.1.3C GENMED缓冲液（Reagent C） 50毫升
GMS50149.1.3DGENMED酶促液（Reagent D） 5毫升
GMS50149.1.3E GENMED反应液（Reagent E） 5毫升
GMS50149.1.3FGENMED底物液（Reagent F） 5毫升
GMS50149.1.3GGENMED阴性液（Reagent G） 5毫升
GENMED细胞CDK4/CYCLIN,D激酶活性光谱法定量检测试剂盒
