大鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子ELISA试剂盒的技术原理

大鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子elisa试剂盒的技术原理

试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中1（sPECAM-1/sCD31） 水平。用纯化的大鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子1（sPECAM-1/sCD31） 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入可溶性血小板内皮细胞粘附分子1（sPECAM-1/sCD31） ，再与HRP标记的可溶性血小板内皮细胞粘附分子1（sPECAM-1/sCD31） 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

    TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的可溶性血小板内皮细胞粘附分子1（sPECAM-1/sCD31） 呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子1（sPECAM-1/sCD31） 浓度。

加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
温育：操作同3。
洗涤：操作同5。
显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 
终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。