HLA血清学分型，HLA I类、II类抗原分型

HLA I类、II类抗原分型实验原理

HLA I类抗原（A、B、C抗原）和HLA II类抗原（DR、DQ抗原）的分型目前国际上统一采用Terasaki改良的微量淋巴细胞毒试验（CDC）实验技术。其原理为当HLA抗体（HLA分型血清）与存在于淋巴细胞膜表面的相应HLA抗原结合后，激活补体，在补体的作用下，细胞膜通透性增加，膜破损，细胞溶解死亡。加入活性染料，后者可通过破损的细胞膜进入细胞内，使细胞染色。在倒置显微镜下通过观察着色的死细胞及数目，可检测淋巴细胞表面是否具有已知抗血清所识别的抗原以及抗原抗体反应的强度。死亡细胞数与抗原抗体反应强度呈正比。

主要试剂与器材

1、淋巴细胞分离液（Ficoll）比重1.077±0.001；

2、PH7.2PBS或0.9%生理盐水；

3、已知型别的标准抗血清，阴阳性对照血清（马抗人IgG为阳性对照血清，AB型男性混合血清为阴性对照血清）；

4、兔补体（无天然细胞毒性）；

5、5%伊红染料；

6、12%甲醛溶液（PH7.2）；

7、医用液体石蜡油；

8、微量加样器（1μl、5μl各一）；

9、倒置相差显微镜；

10、72孔Terasaki微量反应板（细胞分型板）；

11、恒温箱（22~25℃）

12、盖玻片（大小为7.5cm×4.7cm×0.1cm）；

13、HLA血清分型板；

14、尼龙棉（聚酰胺纤维）、尼龙柱（半透明的聚乙烯塑料软管）；

15、含20%小牛血清的RPMI-1640。

操作步骤

1、血清板的制备：72孔或60孔微量试验反应板材料应无细胞毒性，每孔先加医用石蜡油5μl，然后加1μl已知型别的HLA抗血清，置—80℃备用。

2、淋巴细胞的制备：可以从外周血、淋巴结核脾脏中分离淋巴细胞。

从外周血中分离淋巴细胞：抽取5μl外周血，可采用肝素、枸缘酸或脱纤维方法抗凝，用PBS对倍稀释

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沿管壁慢慢加入装有3ml淋巴细胞分离液的试管中

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2000rpm，20℃离心20min

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小心吸取Ficoll上层的絮状白细胞层至另一装有PBS的试管中

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1000rpm，4℃离心10min，洗涤2次

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弃去上清液，混匀细胞沉淀，加0.5~1mlPBS悬浮细胞

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细胞计数，浓度调整为2×10⁶/ml，同时观测细胞活力

HLA-DR、DQ抗原主要存在于B细胞表面，分型时需从上述方法分离的混合淋巴细胞中分离B细胞，常用的方法有尼龙棉柱法、绵羊红细胞玫瑰花环发或免疫磁珠法等。分离所得的T、B细胞悬液应分别进行细胞计数。T、B细胞的比例为5:1左右。如B细胞含量过多，说明B细胞纯度不够。

3、微量淋巴细胞毒反应

从低温冰箱中取出事先加好的HLA I、II分型血清的试验板，室温溶解

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HLA I类分型每孔加入1μl混合淋巴细胞，室温（22~25℃0）孵育30min

HLA II类分型每孔加入1μlB细胞，室温（37℃）孵育60min

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每孔加入兔补体5μl，室温（22~25℃）孵育60min（HLA II类分型孵育120min）

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每孔加5%伊红溶液5μl，3~5min后再加12%福尔马林（PH7.2±0.2）5μl

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室温静置60min或4℃过夜