核酸酶S1（米曲霉）的制备

理化参数：最适pH为4.2.范围在4.0-4.6。

制备方法：米曲霉单链专一核酸酶使用的起始原料是Sigma“粗淀粉酶（米曲霉）”4g，保存于-20℃，6个月内不损失核酸酶活力。

1.粗酶液 4g粗淀粉酶溶于200mL的柱缓冲液+0.05mol/L氯化钠中。柱缓冲液A：0.02mol/L乙酸钠pH4.6,0.1mmol/L硫酸锌，5%甘油。在0℃搅拌1小时。低速离心（10000xg，10min）除去不溶物质。上清液深棕色置500mL瓶内。

2.热处理 用乙酸调至pH5.0。在75℃水浴内加热至70℃（剧烈振荡）。立即在冰水中冷却后，沉淀的蛋白离心除去。以下步骤要在0-4℃中进行。

3.硫酸铵沉淀 上清液加热后调节至200mL，加入100g硫酸铵。搅拌1小时后，离心，弃去沉淀的蛋白。再加40g硫酸铵至上清液，继续搅拌3小时。从未溶的结晶倾泌饱和硫酸铵溶液后，液体离心收集细而分散的蛋白沉淀。沉淀重溶于50mL缓冲液B（0.02mol/L Tris，pH7.5，0.05mol/L氯化钠，0.1mmol/L硫酸锌，5%甘油）为了降低残留硫酸铵浓度，此溶液再用三倍体积的缓冲液B（不含氯化钠）稀释至导电度与缓冲液B同。

4.DEAE纤维素层析 酶溶液吸附在1.8×17cm柱上，流速15mL/h，柱预先用缓冲液B平衡。柱用200mL缓冲液洗涤。流出部分没有核酸酶活力。洗脱时采用400mL线性梯度氯化钠-0.35mol/L含缓冲液B的溶液。流速15mL/h。所有DNA酶和RNA酶以单一峰在0.18-0.22mol/L氯化钠之间出现。合并高峰部分，对2L缓冲液C（0.05mol/L乙酸钠（pH3.8）0.01mol/L氯化钠，0.1mmol/L硫酸锌，5%甘油）透析过夜。

5.磺基Sephadex层析 合并的透析DEAE-纤维素部分吸附在0.8×9cm的磺基Sephadex C-50柱（预先用缓冲液C平衡）上。柱用25mL缓冲液C洗涤后，用一个38mL的氯化钠增至0.16mol/L的缓冲液C梯度洗脱，流速4mL/h。RNA酶和DNA酶的吸收峰在0.04-0.055M氯化钠之间出现。由于缓冲液与核酸酶不可逆失活的pH接近，由于磺基Sephadex树脂在离子强度增加时释放出氢离子，所以测量导电度后在每部分中立即加1/20容积1mol/L乙酸钠pH5.0。

6.Sephadex G-100凝胶过滤 合并上述活力峰，用1/2体积缓冲液A稀释，然后通过0.5mL DEAE-纤维素柱，柱预先用缓冲液A+0.02mol/L氯化钠平衡。吸附的蛋白质用缓冲液A+0.5mol/L氯化钠以浓缩形式洗脱下来。加入蓝色葡聚糖和[³⁵S]甲硫氨酸以标记排阻和包含容积后，此浓缩部分（0.6mL）直接上Sephadex G-100柱（1.8×35cm），柱预先用缓冲液A+0.3mol/L氯化钠平衡。流速4mL/h，分部收集，测定DNA酶，RNA酶，光吸收率和放射性。

所有酶活力与主要的蛋白峰（占90%总蛋白量）重合，此峰在蓝色葡聚糖和[³⁵S]甲硫氨酸之间的2/5出现。合并同前，酶在-20℃保存于50%甘油中。

1.最适pH4.5；活力在pH4.9为50%；在pH6.4时为pH4.3最高活力的2.5%；在pH7.2时为0.1%。

2.EDTA降低活力70%。活力降低通过加入过量的Zn²⁺得到部分恢复。

3.0.12mol/L磷酸缓冲液能使失活。

4.保存于-20℃，50%甘油中。

5.能耐低浓度的十二烷基硫酸钠（至0.04%）。