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原位杂交技术服务
点击次数：710 发布时间：2016/5/19 10:15:31
原位杂交技术服务
原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：
取材
● 0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
● 0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
● 0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
● 0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。
● 4%多聚甲醛浸5min。
● 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
● 预杂交：滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。
● 杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃ 过夜。（阴性对照）
● 洗片：(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min；0.05M PBS 洗 5min×2次。
● 3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.
● 滴加抗-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。
● 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM2 10min×2次。
● 显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。
● 将玻片置于TE中10-30min以终止反应。
● 酒精梯度脱水、二甲苯脱脂。
● 中性树胶封片，显微镜下观察结果。
◆ 概述
原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶 核酸的不同
，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两 类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用 半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究 更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织 细胞的相互关系及功能状态。
◆ 操作流程原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：
取材
● 0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
● 0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
● 0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
● 0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。
● 4%多聚甲醛浸5min。
● 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
● 预杂交：滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。
● 杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃ 过夜。（阴性对照）
● 洗片：(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min；0.05M PBS 洗 5min×2次。
● 3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.
● 滴加抗-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。
● 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM2 10min×2次。
● 显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。
● 将玻片置于TE中10-30min以终止反应。
● 酒精梯度脱水、二甲苯脱脂。
● 中性树胶封片，显微镜下观察结果。
