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DNA实验技术：T4 DNA聚合酶实验
点击次数：1003 发布时间：2013/9/4 16:13:48
标签： T4 DNA 聚合酶
T4 DNA 聚合酶具依赖人为模板的聚合酶活性，同时具有对单链、双链DNA的3’到5’端的外切酶活性，缺少5’到3’端的外切酶活性。
实验方法
- T4 DNA聚合酶
| 实验材料 | DNA |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | Trish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT |
| 仪器、耗材 | 水浴锅 |
| 实验步骤 | 一、50 μl 反应体积： （1）50 mmol/l Tris·Cl，pH8.0 （2）5 mmol/l MgCl2 （3）5mmol/l DTT （4）100 μmol/l 4dNTP混合液 （5）50 μg/ml BSA （6）0.1 U T4DNA聚合酶 （7）2 μg DNA （8）11℃温育20 min，加入2 μl 0.5 mol/l EDTA或75℃加热10 min以终止反应。 （9）反应体枳、4种dNTp的浓度、反应温度可依具体应用而变。 二、dNTp浓度的效应 1. 高浓度的dNTP在通常实验下可以增加聚合酶活性对外切酶活性的比值。 2. 在标记实验中，标记了dNTP的浓度降至1到2 μmol/l，但标记dNTP不能低于1 μmol/l 浓度，否则当dNTP耗竭时，会导致其外切酶活性对的降解。 三、度的效应 用T4 DNA聚合酶标记3’末端时，反应温度保持在11℃，在较髙温度下，其外切酶活性易降解DNA模板。 |
| 其他 | 一、缓冲系统的相容性 许多限制性内切酶能在T4 DNA聚合酶的缓冲系统进行切割反应，同时，T4 DNA 聚合酶也能直接使用。 二、应用 1. 放射性标记DN段的3’末端，含5’凸出端的DN段及浓度为1~2 μmol/l 的适当［α-32P］dNTP，在11℃温育20 min。 2. 选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3’宋端，即所谓的“置换合成”。双链 DN段在dNTP存在下与T4 聚合酶温育，其3’末瑞的外切酶活性导致从 3’末端降解DNA，当补加4种dNTP后，可激活其聚合酶活性，延伸DNA镆板的3’末端。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板时加入4种dNTP混合液，可获得最隹标记效果。 3. 变双链DNA的粘性末端成平端，便于平端克隆。在髙浓度4dNTP种存在下，酶促的 降解终止于双链区，类似地，如果末端存在5‘凸出，酶将延伸凹进陷的3’端直至与5’端平齐。在实际应用中，DNA与T4 DNA聚合酶和浓度各100 μmol/l dNTP在温育20 min。 |
