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DNA实验技术：限制性内切酶消化DNA实验
点击次数：475 发布时间：2013/7/27 14:12:00
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标签： 限制性内切酶 消化 DNA
影响限制性内切酶反应的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。这种抑制可通过增加酶作用单位数、增大反应体枳以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。
实验方法
- 单酶单DNA样品消化
- 消化多个DNA
- 部分消化
| 实验方法原理 | 进行限制酶切割反应只需简单地将酶和DNA样品放在合适的反应缓冲液温育，其中DNA和酶的量、缓冲液的离子强度、温育温度和时间都依具体的反应而改变。 |
|---|---|
| 实验材料 | DNA |
| 试剂、试剂盒 | TE 酶切缓冲液 EDTA |
| 仪器、耗材 | 电泳仪 |
| 实验步骤 | 1. 混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中 （1）x μl DNA （2）2 μl 10×酶切缓冲液 （3）18-x μl H2O （4）20 μl 的反应体积可以方便地用于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析。 （5）只要反应混合物中其他成分的比例保持一定，可增减待切割DNA的量和反应条件。 2. 加入限制性内切酶（1~5 U/μg DNA）在推荐的温度温育1 h （—般是37℃）。 3. 理论上，1 U 限制性内切酶在推荐的反应条件下，60 min 内可完全消化1 μg 纯化的样品。 4. 酶的体积应低于反应总体积的1/10，因为酶液中的甘油可以干扰反应。 5. 加入5 μl 电泳加样缓冲液终止反应，进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。 6. 反应也可通过加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（终浓度为12. 5 mol/l） 以螯合镁离于而终止。 7. 很多酶再65℃温育10 min 可被不可逆灭活，有些不能在65℃热失活的酶在75℃温育15 min 也能失活。 8. 如果酶对热具完全抗性，可遍过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质悬浮法来纯化DNA。 |
原创作者：上海北诺生物科技有限公司
