【感受态细胞的制备】 电击和热击感受态细胞的制备

实验试剂

LB培养基，KB培养基，10%甘油，液氮，0.1M CaC1₂ 溶液

实验设备

超净工作台，摇床，离心机，250mL离心瓶，0. 5mL的离心管

实验材料

大肠杆菌，农杆菌和假单胞杆菌

实验步骤

1. 电击感受态细胞的制备

1） -80℃ 保存的大肠杆菌，农杆菌或者假单胞杆菌在固体平板上（DH5a，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen; P.s. pv. tomato 0288-9和P. syringae pv. tabaci 6505在KB平板上）划线。

2） 接种单克隆于5-10mL液体培养基，37℃ （大肠杆菌）或者28℃ （农杆菌和假单胞杆菌）培养过夜。

3） 按照1:100-1:500转接到500-1000mL液体培养基，37℃ 培养3-4小时（大肠杆菌）或28℃ 培养8-10小时（农杆菌和假单胞杆菌转化）至细菌达到对数生长期。

4） 将菌液装入250mL离心瓶中，冰上放置30分钟后，4℃ 离心15分钟。

5） 弃上清，加入200mL 10%甘油，于冰上缓慢将菌摇散，4℃ 离心15分钟。

6） 重复前一步骤2-3次，最后弃上清，加入少量10%甘油重悬细菌。

7） 分装于0. 5mL的离心管中，每管40ul，液氮速冻，-80℃ 存放。

2. 热激感受态的制备

1） 挑取E.coli BL21单克隆接种到5mL LB培养液中，37℃ 振荡培养过夜。

2） 按照1:100-1:500转接到500-1000mL液体培养基，37℃ 培养3-4小时至细菌达到对数生长期。

3） 将菌液装入250mL离心瓶中，冰上放置30分钟后，4℃ 离心15分钟。

4） 弃上清，加20mL预冷的0.1M CaC1₂ 溶液轻轻悬浮菌体，冰上放置15-30分钟后于4℃ 离心5分钟。

5） 弃上清，加2mL冰预冷的0.1M CaC1₂ 溶液，重悬菌体。

6） 分装于0. 5mL的离心管中，每管40ul，液氮速冻，-80℃ 存放。