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流式表面抗原染色方法

点击次数：1408 发布时间：2013/4/24 16:59:36
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周**
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方案A：细胞悬液的表面抗原染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。

小贴士：
1、流式抗体要储存于避光4度，严格避免冻融。
2、流式抗体使用前要离心3min，避免贴壁盖的损失，请勿斡旋混匀。
3、避免细胞成团，以免堵塞流式细胞仪。
4、eFluor纳米晶体抗体参照该品说明进行改善。


方案A: 细胞悬液的表面抗原染色

实验材料：

15×75mm圆底流式管或96孔板
直标一抗或纯化抗体
二抗（可选）
抗小鼠CD32/16抗体（eBioscience Cat. No. 14-0161）
人FCR结合抑制剂（eBioscience Cat. No. 14-9161）
流式染色液（eBioscience Cat. No. 00-4222）可自行配制
eFluor纳米晶体抗体染色液（eBioscience Cat. No. 00-3222；可选）
7-AAD活度染色液（eBioscience Cat. No. 00-6993）或PI染色液（eBioscience Cat. No. 00-6990）

实验流程：
1、按照样品细胞制备方案制备悬浮细胞，调整浓度为2×107/ml。
2、（可选）封闭FCR介导的非特异性反应：
小鼠：染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗体，孵育20min。
人类：染色之前加20ul 人FCR结合抑制剂孵育20min。
3、等分细胞悬液，每管50ul，再补加50ul染色液。
4、按照抗体说明书加入适量抗体，轻弹混匀。
5、直标抗体。


方案B：淋巴组织细胞制备

实验材料：

60×15mm 的组织培养皿
[5ml 注射器
细胞过滤器（尼龙网过滤）
eBioscience® 流式染色缓冲液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的离心管。

注意：
Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀释为工作液（1:4稀释）。

实验方案：
1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
6、2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。
7、300g 室温离心5min,弃上清。
8、加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。
9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。
10、加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。
11、适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结

原创作者：上海北诺生物科技有限公司

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