银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察

银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察

【实验目的】

通过银染核仁形成区标本制备和观察，了解细胞在不同时相中银染核仁形成区的显微

和亚显微的形态特征。

【实验用品】

一、材料和标本 人外周血淋巴细胞核型标本、HL 一 60 细胞、HeLa 细胞。

二、器材和仪器 显微镜、电子显微镜、超薄切片机、水浴箱、离心机、天平、染色

缸、平皿、乳头吸管、离心管、擦镜纸。

三、试剂 Carnoy 固定液（用时现配）、5N HCl、0.1％甲酸、l％甲酸、50％AgNO3（用

时现配）、2％蛋白胶、5％硫代硫酸钠、2.5％戊二醛、30％～100％梯度乙醇和丙酮、Epon

一 812 包埋剂、醋酸铀和柠檬酸铅染液、蒸馏水。

【实验内容】

一、原理和意义

在细胞分裂中期核型中，人的端着丝粒染色体短臂区和在间期细胞核的核仁中有与银

离子特异亲合物质，通过银染可以显示它们的致量，因此一直被人们所关注。近年来发现，

虽然人的端着丝粒染色体短臂是 28S、18S、和 5.8S rRNA 基因存在部位，称核仁形成区

（Nucleolar organizer region，NOR），但银染的物质不是 rDNA 和 rRNA，而是与活性的 rDNA

转录有关的一类酸性蛋白质，容易将 Ag ＋ 还原为 Ag 的颗粒，从而在核仁形成区镀上银、呈

棕黑色，称为银染核仁形成区（Silver—Staining nucleolar organizer region，Ag—NOR）。

生化和免疫化学研究证明银染蛋白是RNA聚合酶I，其 功能是催化rDNA转录rRNA形成核仁，

因此通过这种反应能够特异显示 rRNA 转录的活性。

由于银染核仁形成区方法简便、特异性强，目前在遗传、肿瘤、药物毒理及预防医学

等细胞生物学研究中，均有广泛应用。特别是电镜银染活性核仁形成区技术，可以在同一

个细胞中显示银染蛋白、活性 rDNA 和 rRNA 三者间关系，并在亚细胞水平进行分析。

二、方法

（一）中期染色体核仁形成区的银染和观察

1．取制备好的正常或肿瘤细胞染色体标本，直接放入装有 5N HCl 溶液中，常温处理 5

分钟。

2．用自来水反复冲洗几次，甩干，标本面朝上平放在平皿中。

3．将 0.1％甲酸临用前配制的 50％AgNO，溶液约 0.5ml,用吸管滴在标本上，再盖上二

片擦镜纸。

4．放置平皿于 56℃水浴中处理 3～5 分钟，待擦镜纸呈棕色后，取出标本用水冲洗、

气干。

5．镜检

镜下所见标本背景浅黄色，核型深染，端着丝粒染色体的银染蛋白存在的部位呈棕黑

色颗粒，选择染色体分散良好，银染颗粒清楚的分裂相，进行计数单侧或双侧有银染颗粒

的染色体数。

人体细胞银染颗粒有遗传稳定性，一般正常值为4～8 个／核型。

计算方法

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NOR 均值=N 个核型中含 NOR 染色体数的和/N 个核型

（二）间期细胞核活性核仁形成区的银染与观察

1．收集培养的 HL—60 细胞和用 PHA 转化的人正常外周血淋巴细胞分别于离心管中，

用 1000rpm 离心 5 分钟后弃上清。

2．用吸管吸打或用指弹法使细胞悬浮，然后用 Carnoy 固定液固定 30 分钟。

3．以 1000rpm 离心 5 分钟，弃上清剩约 0.5～0.1ml 液体，使细胞悬浮后滴片。

4．37℃干燥 24 小时

5．银染（程序同前）

6．镜检

镜下所见，细胞核着色而细胞质不着色，核中活性核仁形成区银染颗粒呈棕黑色，成

簇聚集，清晰可分。肿瘤细胞中与正常细胞中的银染颗粒数量、可见有明显差异。

（三）间期细胞核银染活性核仁形成区电镜标本制备与观察

1．收集培养的 HL－－60 细胞或 HeLa 细胞于离心管中，随后加入 2.5％戊二醛 1ml 预固

定 10 分钟。

2．以 1000rpm 离心 10 分钟，弃上清后加入 Carnoy 固定液固定 5 分钟。

3．接着以 2500rpm 离心 lO 分钟，弃净上清并用吸水纸吸干残余液体，用耳勺取出细

胞团块放于小平皿中。

4．100％乙醇→双蒸水梯度复水，每步 5 分钟。

5．然后将细胞团切成约 1mm 3 大小的块。

6．将 50％AgN03（用蒸馏水配制）—2％蛋白胶（用 1％甲酸配制）2:1 混合液 2～3ml，加

入有细胞团块的小平皿中。

7．移置平皿于 56℃水浴中处理 20 分钟。

8．彻底水洗 3 次，每次 2～3 分钟。

9．水洗后 5％硫代硫酸钠室温处理 lO 分钟。

10．再水洗 3 次，转入乙醇一丙酮梯度脱水，每步 5 分钟。