免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原

免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原

【实验目的】

了解特异性免疫荧光抗体反应的一般过程及其在细胞学研究中的应用。

【实验用品】

一、材料和标本 人体结肠癌培养细胞、HeLa 细胞、小鼠抗人结肠癌细胞抗体（第一抗

体）、荧光标记羊抗鼠抗体（第二抗体）。

二、器材和仪器 盖片、载片、培养瓶、培养皿、滤纸、镊子、吸管、普通倒置显微

镜，荧光显微镜、微量加样器。

三、试剂 1640 培养液（加 lO％小牛血清）、甲醛固定液、0.01mol/L PBS（Ph7.2）、液

体石蜡。

【实验内容】

一、原理和意义

用人结肠癌细胞为免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人结肠癌细胞表面抗原（Ag）的单克隆

抗体 IgG（第一抗体），二者可以发生特异性的抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物，再加

入市售（也可自制）的荧光标记的羊抗鼠 IgG 抗体（第二抗体），可以与复合物进一步发生抗

原抗体反应（二次抗体反应），这样就可以在荧光显微镜下观察到这种抗原在结肠癌细胞表

面的存在（图 19—1）。

图 19 一 l 特异性一次、二次抗原抗体反应过程

二、方法

1．将培养瓶中的结肠癌细胞接种到装有盖片的培养皿中，培养 2～3 天。

2．在倒置镜下观察到盖片上的细胞生长状态良好后，在盖片左上角用玻璃笔做一下标

记，以免在以后的操作中正反面颠倒。

3．将盖片放在甲醛固定液中，4℃固定 5~10 分钟。

4．用 PBS 洗三次，注意不要将 PBS 液直接倒在盖片的细胞面，以免引起细胞大量丢失。

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用滤纸片将盖片上的 PBS 轻轻吸干，不要损伤细胞层。

5．将已稀释好的小鼠抗体滴在盖片上．每个盖片 50μl，37℃温育 30 分钟。

6．用 PBS 洗三次，滤纸吸干。

7．将已稀释好的荧光标记羊抗鼠二次抗体 5μl 滴加在盖片上，37℃温育 30 分钟。

8．用 PBS 洗三次，滤纸吸干。

9．将载片上滴一滴液体石蜡。然后将盖片细胞面朝下放到载玻片上，在荧光显微镜下

观察。

三、结果

细胞多成团块状存在，细胞膜表面显示黄绿色荧光，细胞内及背景均不发光。每组应

设立一个阴性对照组，以培养的 HeLa 细胞为抗原，操作步骤相同。