RIPA裂解液（强）

多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，例如Triton.SDS、NP-40等。RIPA裂解液（强）（Enhanced RIPA Lysis Buffer）,是采用一种经典的细胞组织快速裂解，并获得总蛋白的裂解液，其裂解强度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液（中）。所获得的蛋白质可以用于Western,免疫沉淀（Immunol Precipitation,IP）等。

Enhanced RIPA Lysis Buffer主要由Tris、NP-40、sodium deoxycholate等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

产品组成：

Enhanced RIPA Lysis Buffe 100ml -20℃

自备材料：

1. 低温离心机。

2. PMSF。

操作步骤（仅供参考）：

（-）贴壁培养细胞

1. 取Enhanced RIPA Lysis Buffe置于室温溶解混匀，使用前取适量裂解液加入PMSF，使其最终浓度为1mM.

2. 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3. 按照6孔板每孔加入150-250ul含有PMSF的裂解液的比例，加入RIPA Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解15-30min，通常裂解液作用于细胞1-3秒内，细胞就会被裂解。通常6孔板每孔细胞加入150ul裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200-250ul。

4. 10000-12000g,4℃离心5-10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

5. 进行后续的SDS-PAGE,Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

（二）悬浮培养细胞

1.取Enhanced RIPA Lysis Buffe置于室温溶解混匀，使用前取适量裂解液加入PMSF，使其最终浓度为1mM.

2. 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3.用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔加入150-250ul含有PMSF的裂解液的比例，加入Enhanced RIPA Lysis Buffer。通常6孔板每孔细胞加入150ul裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200-250ul。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

4. 10000-12000g,4℃离心5-10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

5. 进行后续的SDS-PAGE,Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

（三）组织样本

1. 取Leagene Enhanced Lysis Buffe置于室温溶解混匀，使用前取适量裂解液加入PMSF，使其最终浓度为1mM.

2.把组织剪切成细小的碎片，越小越好。

3.取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1-2min之内，以减少蛋白的降解。

4.按照每20mg组织加入150-250ul裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15-30min.

5.步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg加入150-250ul裂解液的比例加入含有PMSF的Enhanced RIPA Lysis Buffe。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1-2min之内，以减少蛋白的降解。

6.10000-12000g,4℃离心5-10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

7. 进行后续的SDS-PAGE,Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项：

1. 在贴壁培养细胞的操作步骤中，去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

2. 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

3. 在培养细胞的裂解中，如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

4. 如果组织样品本身非常小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

5. 溶解Leagene RIPA Lysis Buffe时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。

6. Leagene RIPA Lysis Buffe的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-KB，p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

7. 细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。

8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

原创作者：上海锐谷生物科技有限公司