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Western blot protocol WB实验代测实验步骤
WB实验代测实验步骤
厦门慧嘉生物有限公司多年来，成功为福建厦门各高校实验室代测过很多WB实验，及免疫组化IHC,IHC染色，PCR,ELISA等实验服务
Western blot protocol
步骤：
1. 分离胶和积层胶，制胶板；
注意：灌分离胶时不要加太多。
2. 蛋白变性：准备蛋白样本，加入等体积的2×上样Buffer稀释，置于沸水中煮10min（预染marker煮5min）
3. 加样：每孔加入20～40μl样品
4. 电泳：置于电泳槽中电泳45min，恒定电流90mA（2块板），如为1块板则电流为50mA；
5. 取出胶板，用切割刀修好胶；
6. 将胶置于转膜液中浸泡；
7. 按顺序放好下列物质：黑面→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸（用吸管赶去气泡）→海绵；
8. 置于转膜槽中于，黑面对黑面，加上冰块，加入转膜液；
9. 装好电极，于恒定电压100V下，90min；
10. 丽春红染膜；
11. 用TBST洗去丽春红；
12. 封闭：加入5％脱脂奶粉＋TBST，常温摇床摇1h；
13. 回收封闭液，加入一抗【一抗用5％BSA＋TBS稀释】；
14. 置于4℃摇床摇过夜；
15. 回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；
16. 加入二抗【二抗用5％脱脂奶粉＋TBS稀释】，常温摇床摇1h；
17. 回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次；
18. 将膜置于发光液中浸泡约1min；
19. 将膜铺于曝光盒中，于暗室中曝光，洗胶片。
常用溶液配制：
Ⅰ 细胞裂解液（PLC Lysis Buffer）
|
| Final concentration | 100ml | 500ml |
| 1M Hepes(pH7.5) | 50mM | 5ml | 25ml |
| 5M NaCl | 150mM | 3ml | 15ml |
| Glycerol | 10% | 10ml | 50ml |
| 50mM MgCl2 | 1.5mM | 3ml | 15ml |
| Triton×100 | 1% | 1ml | 5ml |
| 0.5M EDTA(pH8.0) | 1mM | 200μl | 1ml |
| 0.1M NaPPi | 10mM | 10ml | 50ml |
| 0.5M NaF | 10Mm | 2ml | 10ml |
每次提取蛋白前加入1％蛋白酶抑制剂
Ⅱ. SDS-PAGE胶配方及其它常用溶液的配制
1．30%丙烯酰胺
丙烯酰胺 29g
N-N’-亚甲双丙烯酰胺 1g
溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃使其溶解，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌或Whatman 1号滤纸过滤，查证该溶液的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于RT。
注：（1）丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，丙烯酰胺的作用具累积性。
（2）称取时，必须戴手套、口罩；取溶液时也要戴手套。
（3）贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨反应是光催化和碱催化的。应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低，并应在RT下避光保存。每隔数月应重新配制溶液。
2．3M Tris-HCl,pH8.8（用于分离胶）
Tris碱分子量为121.1。将72.66gTris碱溶于重蒸水（不超过200ml）中，加浓盐酸调节pH至8.8，让溶液泠却至RT，再最终调至所需pH值。加重蒸水定容至200ml，1.034×105 Pa，20min高压灭菌，RT贮存。
注：(1)如溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris.
(2)Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。
3．2M Tris-HCl,pH6.8（用于积层胶）
同上方法，将48.44gTris碱加重蒸水定容至200ml，加浓盐酸调节pH至6.8。
4．10%十二烷基硫酸钠（SDS）
在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。
注：SDS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。
5．TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。
6．10%过硫酸胺
过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%（W/V）的贮存液于保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔新鲜配制。
方法：把1gAPS溶解于终量为10ml水溶液中，4℃保存数周。
7. 电泳缓冲液SDS buffer: 10X（running buffer）
Tris base 30.3g
Glycine 144.0g
SDS 10.0g
ddH2O to 1L
(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 0.1%SDS,)
8. 转膜缓冲液Transfer Buffer(10×) pH8.3
Tris base 30.3g
Glycine 144.0g
20%v/v methanol (Fresh!)
ddH2O to 1 L
(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 200ml methanol)
9. TBST(10X) pH: 7.5
Tris base 24.2g
NaCl 80.0g
Tween-20 10 ml
ddH2O to 1L
(1X conc: 100mM Tris base, 150mM NaCl, 0.1%Tween20)
10．Tris缓冲盐溶液（1X TBS，25mmol/L Tris）
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tris碱 3.0g
溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015酚红并用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在15lbf/in2(1.034×105 Pa)，高压下灭菌20min，RT贮存。
11．发光剂
100mM Tris Base（pH8.5） 10 ml
250mM Luminol (in DMSO) 50 μl
90mM P-Coumaric Acid (in DMSO) 22 μl
30%H2O2 2.75 μl
SDS-PAGE Mini-Gel Recipes
7%Running Gel
| gels | 2 | 4 |
| Acrylamide:bis-acrylamide (ml) | 4 | 8 |
| 3M Tris-HCL, pH 8.8 (ml) | 1.5 | 3.0 |
| ddH2O (ml) | 6.28 | 12.56 |
| 10%SDS (ul) | 120 | 240 |
| 10%APS (ul) | 100 | 200 |
| TEMED (ul) | 6 | 12 |
10%Running Gel
| gels | 2 | 4 |
| Acrylamide:bis-acrylamide (ml) | 2.8 | 5.6 |
| 3M Tris-HCL, pH 8.8 (ml) | 1.5 | 3.0 |
| ddH2O (ml) | 7.48 | 14.96 |
| 10%SDS (ul) | 120 | 240 |
| 10%APS (ul) | 100 | 200 |
| TEMED (ul) | 6 | 12 |
12%Running Gel
| gels | 2 | 4 |
| Acrylamide:bis-acrylamide (ml) | 4.8 | 9.6 |
| 3M Tris-HCL, pH 8.8 (ml) | 1.5 | 3.0 |
| ddH2O (ml) | 5.48 | 10.96 |
| 10%SDS (ul) | 120 | 240 |
| 10%APS (ul) | 100 | 200 |
| TEMED (ul) | 6 | 12 |
15%Running Gel
| gels | 2 | 4 |
| Acrylamide:bis-acrylamide (ml) | 6 | 12 |
| 3M Tris-HCL, pH 8.8 (ml) | 1.5 | 3.0 |
| ddH2O (ml) | 4.28 | 8.56 |
| 10%SDS (ul) | 120 | 240 |
| 10%APS (ul) | 100 | 200 |
| TEMED (ul) | 6 | 12 |
Stacking Gel
| gels | 2 | 4 |
| Acrylamide:bis-acrylamide (ml) | 0.75 | 1.5 |
| 2M Tris-HCL, pH 6.8 (ul) | 375 | 750 |
| ddH2O (ml) | 4.8 | 9.6 |
| 10%SDS (ul) | 60 | 120 |
| 10%APS (ul) | 150 | 300 |
| TEMED (ul) | 3 | 6 |
