免疫组化实验代测，WB,PCR,ELISA实验代测

一、 组织蜡块制作及切片

1. 固定：取组织，用PBS漂洗，在离体15分钟之内，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h（固定液用量为组织块体积20倍）。倒去固定液，修整固定后组织块，将挤压受损部分切除，选择包埋面修平。

2. 脱水：用纯水洗3次、每次10分钟；再用50%酒精浸2次、每次1小时，用酒精逐级脱水：70%酒精1天；70%酒精过夜；80%酒精1小时；95%酒精，两次，各2小时；无水乙醇，两次，各45分钟。

3. 透明：1:1无水酒精+二甲苯20min；二甲苯，两次，各15min。

4. 浸蜡：恒温箱内进行，58℃左右为宜。将组织块浸入石蜡，1:1二甲苯+软石蜡（54℃）45分钟；硬石蜡（58℃）1、2各45分钟。

5. 包埋：预先将包埋用石蜡融化备用，将预热的包埋金属框架中注满石蜡液，将组织块迅速移入浸没，背面再平按上固定框，室温过夜凝固。

6、切片：调整刀架基座使角度刻线为5度后固定架锁调右侧旋钮调整切片厚度在3-5um，待刀刃接近蜡块切面后，匀速转动快进转轮、速度约2转/秒。

7、贴片：用小毛刷将组织石蜡片带粘到盛有45-50℃温水中，，将组织带黏在载玻片上，水平放置晾干。

8、烤片：将贴片后的载玻片水平放置于60℃恒温箱内烤片4h。制作好的切片保存于4度。

二、染色

1. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精。

2. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，高压修复3分钟。

3. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上10%血清，然后放入37°C温箱中半小时。

4. 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。

5. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗5次，每次3min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。

6. 加SP:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗5次，每次3min，擦干组织周围的PBS后加上SP, 然后置于37°C温箱中半小时。

7. 加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上AEC显色剂，镜下控制显色时间。

8. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，加入苏木精染色。

9. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精。

10. 封片：用水性封片剂滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。 

11. 拍照：封片后于光学显微镜400×镜下拍照。