细胞内氧化应激活性氧（ROS）红色荧光测定试剂盒产品说明书

主要用途

YIJI 细胞内氧化应激活性氧（ROS）红色荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氢溴化乙啶，

在细胞氧化条件下，产生红色荧光，来定量检测细胞内活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养

学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical； O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基（hydroxyl

radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，

将导致细胞衰老或凋亡。二氢溴化乙啶（Dihydroethidium bromide；Hydroethidine；DHE）是一种完全自由

通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不外漏的染色剂。一旦被超氧自由基阴离子氧化，二氢溴化乙啶转化

为溴化乙啶，进入细胞核，与DNA紧密结合，便产生荧光。据此测定细胞内活性氧族的浓度。

产品内容

YIJI 清理液（Reagent A）

YIJI 染色液（Reagent B）

YIJI 稀释液（Reagent C）

YIJI 保存液（Reagent D）

产品说明书

毫升

微升

毫升

毫升

1份

保存方式

保存YIJI 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在 4℃冰箱里，有效保

证 12 月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（YJ12052）：用于细胞操作所需的培养基

15 毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器

1.5 毫升离心管：用于细胞染色的容器

血细胞计数仪：用于细胞计数

台式离心机：用于沉淀细胞

细胞流式仪：用于细胞荧光分析

（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光细胞

1

实验步骤

一、 间接法

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI 稀释液

（Reagent C）放进 37℃恒温水槽里预热。然后移出

毫升离心管，加入

室里。然后进行下列操作。

1． 准备 1 瓶 25cm2 细胞培养瓶的待测细胞

2． 小心抽去细胞培养液

3． 加入

毫升 YIJI 清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面

4． 小心抽去 YIJI 清理液（Reagent A）

5． 加入 1 毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面

6． 置入 37℃培养箱 1 分种

7． 振动培养瓶，使细胞脱落

8． 加入 4 毫升用户自备的完全细胞培养液

9． 移入 15 毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）

10．移取 10 微升在血细胞计数仪上进行细胞计数

11．移出 1 X 106 细胞到新的 15 毫升锥形离心管

12．放入台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g

13．小心抽去上清液

14．加入

毫升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和 YIJI 稀释液（Reagent C）的 YIJI 染色工作

液，轻柔混匀

15．放进 37℃恒温水槽孵育 20 分钟，避免光照

16．放入台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g

17．小心抽去上清液

18．加入预冷的

19．放进冰槽里

20．选择下列方式之一进行操作：

a）

即刻进行细胞流式仪分析：波长 540nm 氩离子激光，观察 50000 个细胞以上――

波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高

b）

或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

微升 YIJI 保存液（Reagent D），轻柔混匀细胞颗粒群

微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新的 1.5

微升 YIJI 稀释液（Reagent C），混匀后，标记为 YIJI 染色工作液，置入暗

1）移取 10 微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片

2）激发波长 540nm，散发波长 590nm――

红色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高

c）

或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：

微升 YIJI 保存液（Reagent D）

1）移取 400 微升上述细胞悬液到 1 毫升比色杯

2）加入

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：激发波长 540nm，散发波长 590nm――

RFU 增高，表明活性氧族（ROS）含量高

2

二、 直接法

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI 稀释液

（Reagent C）放进 37℃恒温水槽里预热。然后移出

毫升离心管，加入

室里。然后进行下列操作。

1．准备 1 个细胞培养 24 孔板的待测细胞，细胞铺满率达 70％

（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm 培养皿，和其它培养孔板，见注意事项 5）

2．小心抽去细胞培养液

3．小心沿着孔壁加入

微升含有 YIJI 染色液（Reagent B） YIJI 稀释液和（Reagent C） YIJI的

染色工作液到 1 个细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4．放进 37℃细胞培养箱里孵育 20 分钟

5．小心抽去含有 YIJI 染色工作液的细胞培养液

6．小心沿着孔壁加入 500 微升 37℃预热的 YIJI 保存液（Reagent D）到细胞培养孔

7．选择下列方式之一进行操作：

（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：

激发波长 540nm，散发波长 590nm――红色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高

（B）

高

使用荧光酶标仪检测（定量检测）：

微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新的 1.5

微升 YIJI 稀释液（Reagent C），混匀后，标记为 YIJI 染色工作液，置入暗

放进荧光分光光度仪：激发波长 540nm，散发波长 590nm――RFU 增高，表明活性氧族（ROS）含量

注意事项

1． 本产品为 20 次操作

2． 所有操作均须无菌状态下进行

3． 操作时，须戴手套

4． 孵育时，必须避免光照

5． 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm 培养皿，和各种培养孔板，须相应调

整操作用量：

操作容器

载玻片

载玻片培养皿

35mm 培养皿

96 孔培养板

48 孔培养板

24 孔培养板

12 孔培养板

6 孔培养板

25cm2 细胞培养瓶

操作用量

100 微升

1 毫升

1 毫升

100 微升

200 微升

500 微升

1 毫升

2 毫升

3 毫升

6． 根据细胞类型，调整 YIJI 染色工作液使用剂量（1：200 至 1：1000 容量比），避免过度染色

7． 建议细胞染色完成后，即刻进行细胞荧光分析

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