高效液相色谱法测定奶粉中的三聚氰胺

摘要：本文根据国家标准GB/T 22388—2008 《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》，建立了利用我公司高效液相色谱测定奶粉中三聚氰胺的方法：色谱柱：Cl8柱；流动相 ：离子对试剂缓冲液—乙腈（90+10，体积比）；流速 ：1 mL／min；进样量：20 μL；紫外检测器，波长 240 nm。柱温：40 ℃ ± 1 ℃。方法在0.8 μg/mL到80μg/mL之 间线性良好，，线性相关系数r≥0.999，泛酸的回收率在 85.45％～92.77％之间。对客户提供的奶粉样品进行检测发现，样品中未检出三聚氰胺的含量。

关键词： 高效液相色谱 ；三聚氰胺；奶粉

三聚氰胺是一种重要的化工原料，是作为塑料、涂料等行业的改性剂。普通的全氮测定法测奶粉等食品中的蛋白质含量时不能排除这类伪蛋白氮的干扰，一些违法企业为了提高产品中的蛋白质含量将其作为伪蛋白质非法添加到食品、饲料等产品中^[1]。三聚氰胺本身毒性轻微，但实验研究结果显示，它一旦与氰尿酸结合后会形成晶体，进而造成肾中毒。严重影响人类健康^[2]。

本文将试样用三氯乙酸溶液—乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量测定三聚氰胺的含量。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

1.1.1 试剂及试剂的配制

1.1.1.1 甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）。

1.1.1.2 乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.1.3 氨水：含量为25%～28%（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.1.4 三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.1.5 柠檬酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.1.6 辛烷磺酸钠（色谱纯，Alfa Aesar）。

1.1.1.7 甲醇水溶液：准确称取50 mL甲醇和50 mL水，混匀后备用。

1.1.1.8 三氯乙酸溶液（1%）：准确称取10 g三氯乙酸与1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

1.1.1.9 氨化甲醇溶液（5%）：准确量取5 mL氨水和95 mL甲醇，混匀后备用。

1.1.1.10 离子对试剂缓冲溶液：准确称取2.10 g柠檬酸和2.16 g辛烷磺酸钠，加入约980 mL

水溶解，调节pH至3.0后，定容至1 L备用。

1.1.1.11 三聚氰胺标准品 （纯度99%，J&K Chemical）。

1.1.2 标准溶液配制

三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg·mL^-1 的标准储备液，于 4 ℃避光保存。

用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80 μg·mL^-1 的标准工作液。

1.1.3 仪器及设备

1.1.3.1 LC 高效液相色谱仪：配有紫外检测器。

1.1.3.2 分析天平：感量为0.0001 g。

1.1.3.3 离心机：转速不低于4000 r·min^-1。

1.1.3.4 超声波水浴（DS6150，Do-Chrom）。

1.1.3.5 阳离子交换固相萃取柱：（SCX，Agilent Technologies）硅胶基质的强阳离子交换柱（苯磺酸化硅胶），60 mg，3 mL，或相当者。使用前依次用3 mL甲醇、5 mL水活化。

1.1.3.6 氮气吹干仪（MTN-2800D，Auto Science）。

1.1.3.7 涡旋混合器。

1.1.3.8 具塞塑料离心管：50 mL。

1.1.3.9 定性滤纸。

1.1.3.10 微孔滤膜：0.2 μm，有机相。

1.2 仪器条件

色谱柱：C₁₈柱，250 mm×4.6 mm，5 μm。

流动相：离子对试剂缓冲液—乙腈（90+10，体积比）。

流 速：1.0 mL·min^-1。

柱 温：40 ℃。

波 长：240 nm。

进样量：20 μL。

1.3 样品处理过程

1.3.1 提取

称取2 g（精确至0.01 g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r·min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。

1.3.2 净化

将待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL·min^-1。洗脱液于50 ℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

待仪器稳定后，将标准溶液按浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线如图1。线性方程，相关系数及检出限如表1所示。

表1 标准曲线和检出限

图1 三聚氰胺标准曲线

图2 三聚氰胺标准样品线性色谱图

2.2 样品分析及结果

2.2.1 空白试验

除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。空白样本的色谱图见图3。

图3 空白样本色谱图

空白实验样本中未检出三聚氰胺。

2.2.2 试样测定

根据《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》^[3]规定，HPLC的定量限为2 mg·kg^-1。某品牌奶粉在重复性条件下，获得三聚氰胺两次独立测定结果如下，见表2、图4、图5。

表2 某品牌奶粉中三聚氰胺两次独立测定结果 （单位：mg·kg^-1）

图4 样品第一次独立测定色谱图

图5 样品第二次独立测定色谱图

由图2可知，三聚氰胺标准样品的保留时间在32min左右，样品谱图中在32min左右未出三聚氰胺的色谱峰，因此可判断样品中未含三聚氰胺。

2.3 回收率

在样品中分别添加2 mg·kg^-1、6 mg·kg^-1和 10 mg·kg^-1三聚氰胺标准品，做回收率实验。

表2 三聚氰胺回收率测定结果

在添加浓度2 mg·kg^-1～10 mg·kg^-1浓度范围内，回收率在85.45%～92.77%之间。

3 结论

3.1 高效液相色谱法测定三聚氰胺，成本低，不需要衍生，简便易行。

3.2. 三氯乙酸使蛋白质形成沉淀，三聚氰胺则保留在滤液中。

3.3 三聚氰胺呈弱碱性，净化过程一般选择阳离子交换柱。通过两种不同溶液的洗涤（水和甲醇），使样品更干净，提高检测灵敏度。具有批次重复性好，回收率高，重现性好等优点。

3.4 缩短分析时间与提高分离度的要求是相矛盾的。在能得到较好的分离度结果的前提下分析的时间越短越好。为了缩短分析时间。可以适当提高流动相中乙腈的比例。

参考文献

[1] 三聚氰胺假蛋白原理[Z/OL].百度百科. http://baike.baidu.com/view/298398.htm

[2] 三聚氰胺与氰尿酸毒性初步风险评估以及食物含量的指导意见[R/OL].世界卫生组织

[3] GB/T 22388—2008. 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法[M].

原创作者：北京京科瑞达科技有限公司