协议的实时RT

协议的实时RT

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本议定书中描述的详细的实验程序，实时定量RT - PCR荧光绿色我提到校尉王和布瑞恩种子（2003）聚合酶链反应引物行基因表达的定量分析。核酸研究31（24）：e154 pp.1-8。请参阅本文和primerbank帮助页面的背景信息。这项协议也可在微软文字格式。这是一张简洁的协议。该程序开始逆转录合成核糖核酸。基因是用来作为模板的实时聚合酶链反应基因特异性引物。你可能需要修改此协议如果你使用不同的试剂和仪器的实时聚合酶链反应。

所需的时间

合成：2小时。

实时聚合酶链反应：2小时。

解离曲线分析：0.5小时。

试剂和设备

寡核苷酸引物。基因特异性引物是取自primerbank（网址：/ /美巡赛。麻省总医院，哈佛大学教育/ primerbank /。。）。这些引物是从麻省总医院基因核心设施（网页：/ / dnacore麻省总医院，哈佛大学。。。教育/合成/指标说明。）。所有引物的脱盐和紫外吸收光谱和毛细管电泳是用来评估质量的引物合成。

小鼠全肝核糖核酸（盒）。

小鼠总主面板（屋宇署生物/试剂）。

绿色荧光聚合酶链反应混合大师，200反应（应用生物系统公司）。

光管、帽条（应用生物系统公司）。

上标第一链合成系统技术（公司）。

25阶梯（公司）。

阿比棱镜7000序列检测系统（应用生物系统公司）。

阿比棱镜7000十二烷基硫酸钠软件（应用生物系统公司）。

3% readyagarose预制凝胶（仪）。

琼脂糖凝胶电泳仪（仪）。

详细程序

反转录

反转录进行标第一链合成系统技术。下面的程序是基于公司的协议。

1。准备以下核糖核酸/引物混合物在每个管：

总核糖核酸5毫克

随机六聚体（50毫微克/毫升）3毫升

10毫米的核苷酸和1毫升

乙酯水10毫升

2。孵化的样本在65摄氏°5分钟，然后在冰上至少1分钟。

3。反应混合物准备硕士。对于每一个反应：

10逆转录缓冲液2毫升

25毫米氯化镁4毫升

0.1米的地面2毫升

rnaaseout 1毫升

4。加入反应混合物的核糖核酸/引物混合物，混合，然后在室温下2分钟。

5。加入1毫升（50单位）的二标逆转录每管，混合和孵化在25摄氏°10分钟。

6。培养管在42°为50分钟，热灭活在70摄氏°15分钟，然后寒气冰。

7。加入1毫升的核糖核酸酶和孵化在37摄氏°20分钟。

8。商店第一链基因在- 20摄氏°直到使用实时聚合酶链反应。

实时聚合酶链反应

1。规范和基因特异性引物浓度正向和反向引物。每个引物（正向或反向）浓度的混合物为5毫升。

2。建立实验和下列程序于阿比棱镜十二烷基硫酸钠7000。不要点击分离协议，如果你要检查产物琼脂糖凝胶。保存副本的安装文件并删除所有循环（用于以后的解离曲线分析）。请注意推广步骤略有不同，描述了在我们的文件。

1）50°2分钟，1周期

2）95°10分钟，1周期

3）95°15 - > 60 - > 72 - 30°°碳30，40个周期

4）72°10分钟，1周期

3。实时聚合酶链反应的反应混合物可以是50毫升或25毫升的混合物准备在每一个光管。

25毫升绿色荧光组合（2倍）

0.5毫升的肝脏基因

2毫升的引物组合（5 mol /毫升每个引物）

22.5毫升水或12.5毫升绿色荧光组合（2倍）

0.2毫升的肝脏基因

1毫升的引物组合（5 mol /毫升每个引物）

11.3毫升水

4。反应完成后，将管子从机器。聚合酶链反应特异性审查3%琼脂糖凝胶用5毫升的每一个反应。

5。把管在十二烷基硫酸钠7000和执行解离曲线分析与保存复制安装文件。

6。分析实时聚合酶链反应的结果与十二烷基硫酸钠7000软件。检查，看看是否有任何双峰解离曲线或异常扩增曲线。

故障排除

在这里，我列举一些实时聚合酶链反应失败的主要原因。请阅读primerbank帮助页面了解详情。

很少或没有反应的产品。质量差的模板，引物，聚合酶链反应试剂或可能导致失败。首先，请包括适当的反应控制来消除这些可能性。一些基因表达的瞬时或只在某些组织。在我们的经验，这是最有可能引起消极反应的结果。请阅读文学作品的基因表达模式。一个需要注意的是，芯片并不总是可靠的测量基因表达。之后切换到适当的模板，我们得到