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活体成像果蝇细胞组织培养
实时成像提供了一个重要的互补的“快照”的说法得到了在固定组织的免疫。它允许动态细胞过程所展现的“体内”，而且往往揭示了复杂程度不可能在静止图像的研究。由于越来越多的兴趣在这一技术，重大的技术改进，已在最近几年在显微镜导致更敏感和更快的相机，更高效的过滤集和各种不同的显微镜系统选择。时间方面的细胞过程中的显微镜仍然往往被忽视，由于困难的技术安装和必要制作你自己的工具。现在大部分所需的设备商用显微镜制造商和关联公司包括环境室，co2-control和温度控制。
经常被用来与时间推移显微镜的荧光蛋白质，如绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白）或红色荧光蛋白（利福平；沙纳等人。，2004；沙纳等人。，2005；维登曼等人。，2004）和染料。同样，这是一个迅速发展的研究领域，它提供了各种不同的“口味”的荧光蛋白质科学界与性能，特别适合不同生活成像应用（用于指导选择合适的人，看到沙纳等人。，2005）。
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程序
细胞和荧光蛋白质
生长条件，转化和筛选稳定细胞系的描述（cherbas等人。，1994）使用100µ克/毫升潮霉素作为筛选剂。下面的协议，可以使用最果蝇细胞组织培养只要是semi-adherent。
我测试了多种不同的果蝇细胞的生长行为和发现，大多数人遇到了一些困难，接受和完成胞质，膜生产泡沫和剩余的依恋很久。这些表型是最明显的一个电子细胞称为L 2 - 4，我已经用了大多数应用程序（从botchan实验室，171之厅，脐血，伯克利，加利福尼亚州，94720，美国）。
荧光蛋白质，如绿色荧光蛋白（计划生育）（试剂）是一个很好的选择，为绿色和mcherry的红色通道（沙纳等人。，2004）。取决于性能的蛋白质的兴趣，计划生育是可以被用来作为一个N -末端或C -末端融合和一般的细胞毒性。
计划生育的融合蛋白（如重组）是一个很好的选择染色体计数器污点。赫斯特33342和draq5是具体的生活，不染色显着其他核酸。不幸的是他们是有毒的果蝇细胞组织培养后长期暴露（> 2小时）浓度，给出一个合理的信号噪声比。此外，紫外光源激发Hoech st 33342染料也具有破坏性的基因与较低的波长用于计划生育的或draq5。
虽然生活成像可以进行瞬时转染细胞，很大比例的细胞显示三极纺锤体的有丝分裂（~ 30%比5%对照或稳定的细胞），因此最好使用稳定细胞系的选择研究的有丝分裂。
生长和细胞的制备
细胞镀在1x106 /毫升施奈德的介质（灭活/公司），10%个功能界别，抗生素（西格马a5955；用来在瑞士不是100倍）在25°和使用2天后，当细胞培养应成倍增长与密度的~ 3x106 /毫升（生成时间~ 23小时）。
这是一个简单的方法活细胞成像施奈德时间短（< 6小时），可用于在直立和倒置显微镜（见注1，注2和1）：
22x22mm盖玻片和特种玻璃幻灯片与圆形凹陷的清洗用70%乙醇。真空润滑脂的应用到边缘的圆形凹陷的幻灯片。由于时间短，成像，不育的问题；
10µ升悬浮细胞被添加到该中心的研究；
抑郁症幻灯片放在顶部的“三明治”下拉描述为“悬滴法”（参见图1；2；衍等人。，2006；盾牌和唱，1970）；
细胞可以解决~ 10分钟前成像。
时移成像的细胞多天以下协议可以使用（仅用于倒置显微镜）（见注3）：
培养皿或幻灯片盖玻片底部的使用。一些供应商生产圆文化菜肴（如willco威尔斯公司®）或8-well或单井文化幻灯片（如情报™或ibidi®，见图2）；
遵循细胞多天最好是预培养皿或幻灯片与多聚赖氨酸减少细胞运动。总之，幻灯片或菜培养30分钟0.01%多聚赖氨酸，排水和允许干
材料与试剂 果蝇细胞 施奈德的介质（灭活/公司），10%胎牛血清，抗生素（西格马a5955） 抑郁症的幻灯片（卡尔公司） 1.5号（盖玻片厚度平均170µ米）是最佳的奥林巴斯™显微镜也建议其他显微镜制造商。 文化幻灯片/菜（ibidi®，lab-tek™腔盖片/情报™战斗靴，威尔斯®） 可选：0.1%多聚赖氨酸的股票（西格玛，p8920） 可选：刀豆素A（西格玛，c2010-25mg） deltavision spectris®和deltavision逆转录®系统采用倒置荧光显微镜奥林巴斯™。 过滤集从色度™或semrock™（达特过滤器设置）。 温度受控环境室间科学™，皮康™，蔡司™或奥林巴斯™。 图像分析软件（softworx®探险家，应用精密™，位平面imaris®变形，®，微软软件™）。 回到顶部 作者笔记 细胞分裂在这些条件下至少一天。时间较长，细胞应在培养皿盖玻片底部（见协议很长一段时间）。 史奈德2细胞semi-adherent，具体的治疗的研究是不需要的。如果细胞应固定，酸洗盖玻片可涂用0.01%多聚赖氨酸溶液（见协议）。如果扁平细胞是理想的酸洗盖玻片，应涂concanavalin-a.酸洗22x22mm盖玻片，治疗100µ我0.5mg/ml刀豆（西格马）在水和允许空气干燥（罗杰斯等人。，2002）。然而许多细胞未能完成胞质和成为双核在这些条件。 在所有这些实验中稳定的条件在显微镜是强制性的，如略有偏差，温度可以改变焦点大大。这可以实现分离的显微镜强气流（如空调的房间的窗帘也有用的创建一个黑暗的分区的房间）和使用环境室，封装的显微镜。恒定温度的温控室才能保证如果显微镜室至少是5°低于室温度。另外，但不太精确的是利用加热段温度控制。除非环境室，既可以冷却和加热，上述设置几乎总是需要空冷系统的房间。 文化威尔斯幻灯片上安装有优势，幻灯片可以定位在一个可重复的方式在显微镜阶段。这使得以幻灯片和关闭和确定以前观察到细胞的坐标。 使用奥林巴斯™planapo 60倍目的是可取的物镜，因为它是更敏感的还提供了一个体面的光学分辨率可视化子细胞（染色体，核机构，微管）。 回到顶部 审稿人的意见 审查：波斯蒂加maiato，大学分子和细胞生物学，大学的波尔图，葡萄牙。 利用悬滴法离开氧可能是重要的长期记录。一种替代短期记录（6小时）是使用封闭商会（如玫瑰商会）全中。 替代多聚赖氨酸，这只是帮助坚持细胞的玻璃，和刀豆素A，平展细胞通过膜受体和可能妥协的胞质，是使用s2r +细胞。这克隆原来孤立的伊莫金公司（公司，1972）和长贴玻璃没有任何涂层和作为一个松散的单层，主要上皮样外观。相对于正常细胞，这种克隆表达翅受体dfrizzled-1和dfrizzled-2，因此新命名的“二受体加”（s2r +；柳川等人。，1998）。另一个替代图像平面细胞短时间（2 - 3小时）是使用琼脂覆盖（maiato等人。，2004）。为了某些目的，这种方法的效果优于所有其他的，因为它的基础上的表面张力的液体和一个压力梯度，使可视化细胞是平坦的足够的显微镜，而不损害细胞的可行性。 上海劲马生物科技有限公司是国内生物科研行列里的佼佼者，连续5年销量第一，与国内众多的大型企业，医院，学校科研单位合作，一起取得了很好的成绩，我们单位，主要经营的产品有：elisa试剂盒，生物试剂，血清，标准品，培养基，抗体。欢迎给位前来咨询。
