地高辛配基随机标记DNA探针

1．标记DNA探针　每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。
　　（1）DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。
　　（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及试剂：
　　新鲜变性的DNA 　　　　　　　　　1-3μg
　　六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　2μl（管5）
　　dNTP标记用混合底物 　　　　　　　2μl（管6）
　　加无菌重蒸水至　　　　　　　　　 19μl
　　DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）　　　1μl（管7）
　　（3）在37℃保温至少60min，可到20h。
　　（4）煮沸5min，终止反应。
　　（5）15000rpm离心30s，置于冰上待用。

　　2．预杂交　按100cm2膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。
　　预杂交液组成：5×SSC
　　0.5%（W/V）封阻试剂（管11）
　　0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠
　　0.02%（W/V）SDS
　　膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。

　　3．杂交　按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。
　　杂交液组成： 50%甲酰胺（V/V）
　　5%（W/V）封阻试剂
　　5×SSC
　　0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠
　　0．02%（W/V）SDS
　　新变性标记DNA（150ng/ml）

　　杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜（16～20h）。

　　4．洗膜　　按100cm2膜用250ml洗膜液计算。
　　（1）在室温下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。
　　（2）在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。
　　（3）在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。

　　5．免疫测定

　　（1）配制溶液
　　缓冲液1：Tris-HCl（100mmol/L）;NaCl（150mmol/L）pH7.5（20℃）
　　缓冲液2：0.5%（W/V）封阻试剂（管11）,配制于缓冲液1中（封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊）。
　　缓冲液3：Tris-HCI（100mmol/L）;NaCI（100mmol/L）;MgCI2（500mmol/L）pH9.5（20℃）。
　　缓冲液4：Tris-HCl（10mmol/l）;EDTA（1mmol/L）;pH8.0（20℃）
　　显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸盐缓冲液（管10）。

　　2． 显色过程
　　A．膜在缓冲液1中短暂洗涤（1min）。
　　B．在100ml缓冲2中保温30min。
　　C．再用缓冲液1短暂洗涤。
　　D.用缓冲液1稀释的抗体结合物（管8）至150U/L（1:5000）;稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。
　　E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。
　　F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。
　　G.膜在缓冲液3中平衡2min。
　　H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。
　　I．当要求的点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。
　　J．摄相。
　　说明：上述各反应均在室温下进行，除了显色反应外，均需振荡或搅拌。

　　（五）排除实验中问题的方法

　　1．DNA不能有效地被标记时考虑
　　（1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNA。
　　（2）标记反应的保温时间延长（增至20h）。
　　（3）DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。

　　2．不能达到预期的灵敏度时考虑
　　（1）DNA标记率。
　　（2）增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。
　　（3）显色反应的时间可延长至3d。

　　3．若显色时背景过深，可采取
　　（1）在杂交溶液中减少标记DNA量。
　　（2）增加杂交溶液的体积，使膜随意漂浮在溶液中。
　　（3）某些类型的尼龙膜可能产生深色背景，因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。
　　（4）在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。

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