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维生素K的测定方法
点击次数：1165 发布时间：2012/8/10 10:04:02
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| 维生素K的测定 | |||||
| 此处介绍蔬菜中维生素K1的测定方法（HPLC法）和食物及饲料中水溶性维生素K3（甲萘醌）的测定方法 一、蔬菜中维生素K1的测定方法-HPLC法 1.原理 蔬菜中的维生素K1经有机溶剂提取后，经失活的磷酸盐处理过的氧化铝色谱柱进行净化，再用液相色谱法将维生素K1分离并进行定性定量测定。 2.适用范围 本标准适用于各类蔬菜、绿色植物及其干制品中维生素K1的测定。 3. 仪器： （1） 实验室常用设备 （2） 打碎机 （3） 202-R型恒温干燥箱 （4） 色谱柱：为0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收缩变细，并装有活塞，活塞上约1 cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为16～30μm，柱上端膨大为容积约30ml的储液池。使用前需干燥 （5） 旋转蒸发器 与旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶：具塞，圆底，容积为150ml。 （6） 恒温水浴锅 （7） 高纯氮气 （8） 高速离心机 与高速离心机配套的小离心管：具塞，容积为1.5～3.0ml。 （9） 紫外分光光度计 （10） HPLC：高效液相色谱仪，带紫外检测器 4.试剂 除特殊说明实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯，有机溶剂使用前需重新蒸馏。 3.1 无水硫酸钠：使用前需在150℃的烘箱内烘烤4～8小时，以去除水分。 3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：称取20g无水硫酸钠，用蒸馏水溶解后定容至1L。 3.3 丙酮：分析纯。 3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析纯。 3.5 0.6mol/L碘化钾溶液：称取10g碘化钾，用蒸馏水溶解定容至100ml。 3.6 5g/L淀粉液：称取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。 3.7 ：分析纯。不含过氧化物。 （1） 过氧化物的检查方法：用5ml加1ml0.6mol/L碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。或加4滴5g/L淀粉液，水层呈蓝色。则该含有过氧化物需处理后使用。 （2） 去除过氧化物的方法：重蒸时瓶中加一段纯铁丝，弃去10%初馏液和10%残留液。 3.8 洗脱液：石油醚+（97+3）。 3.9 甲醇：优级纯。 3.10 正己烷：优级纯。 3.11 磷酸氢二钠：分析纯。 3.12 中性氧化铝：100～200目。 3.13 氧化铝的处理： （1） 磷酸盐处理氧化铝：取250g中性氧化铝，20g磷酸氢二钠，1.6L蒸馏水，放入容积为2L的锥形瓶中沸水浴30min，不时摇动或搅拌。冷却，倒掉上层液体（包括悬浮的细小颗粒），然后用布氏漏斗抽滤。将残留物转至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至两次称量相差3g以下，烘烤过程中不时搅拌，以避免结块，冷却后放入干燥器中保存。 （2） 失活处理氧化铝：使用前，将磷酸盐处理的氧化铝，加入具塞锥形瓶中。每100g氧化铝加9.0ml去离子水，盖紧瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加热3～5min，剧烈摇动锥形瓶，使氧化铝可以自由流动，无结块。冷却，静置30分钟，使水分分布均匀。 （3） 验证处理过的氧化铝：取标准应用液1.0ml，用氮气吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3装柱，将标准溶液加入柱上，按5.4净化步骤进行柱色谱，用旋转蒸发瓶收集洗脱流出液，浓缩，氮气吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC测定，记录峰面积或峰高（A）。另取标准应用液直接测定，记录峰面积或峰高（Ar）。将A与Ar进行比较，其值在0.97～1.03之间（A/Ar），则说明柱效较好，氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处理。如果再次验证比值仍不能达到0.97，则需重新制备氧化铝。 3.14 维生素K1标准：Sigma公司，纯度>98%。 3.15 标准贮备液：精确称取50.0mg维生素K1标准，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。将储备液分装成安瓿，冷冻保存。 3.16 标准工作液：取标准贮备液， 用正己烷准确稀释50倍, 即20.0μg/ml。 标准工作液的标定：取标准应用液测定紫外吸光值，波长248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，测定3次，取平均值，按下式计算标准应用液浓度。
式中： X1 －－ 维生素K1标准应用液浓度，μg/ml； |
原创作者：河南省达兰科技有限公司
