反相色谱柱的使用注意事项总结

反相柱的安装与活化

新开启的反相色谱柱，出厂保存溶剂一般是甲醇或85%甲醇。我们拿过来先不要着急使用到具体的方法上。

1，将色谱柱入口端连到液相上，用甲醇或乙腈冲柱，出口端用废液缸接着，看出口端是否有气泡流出（避免气泡进入检测系统），若有气泡，则用甲醇或乙腈冲干净气泡，然后再连接到检测器入口端。

2，如果实验所需流动相不含有盐，直接切换初始梯度比例的流动相平衡色谱柱即可；如果流动相含有盐，先用高比例水相（如水/乙腈=90：10）过渡，然后再切换至含有盐的流动相初始梯度比例平衡色谱柱。

3，色谱柱平衡过程，先是柱压逐渐平稳，然后基线走平，看平衡柱体积在10个柱体积以上。就可以运行方法，进样检测了。

反相流动相及样品的制备

1，有机溶剂须使用HPLC别以上的，水尽可能使用超纯水；,

2，添加盐的流动相，须经过孔径≤0.45μm的滤膜过滤（滤膜确保与流动相兼容，不会被溶解）；

3，当缓冲盐浓度较高时（50mM以上），可以在有机相中添加一定比例的水（如乙腈/水-80：20），避免梯度有机相比例过高，造成盐析。

4，避免单一相长时间使用一瓶100%水相流动相，水相容易滋生细菌（尤其含有缓冲盐时），水相一般1-3天更换（更换频次视室温而定）。有时需要配置大量水相长时间使用时，可以添加3-5%的有机相，来有效抑制长菌。

5，流动相避免敞口放置，会落入灰尘、细菌，且含有有机相时会部分挥发，造成比例变化，不能重现，还会影响人员的身体健康。

6，待测样品的制备：

①称量样品后，尽量用初始梯度比例的流动相去溶解到我们需要的浓度；

②如果溶解性差，可以加一些助溶试剂（如DMF）；

③进样过一下≤0.45μm的滤膜，如果样品比较复杂，含有过多基质，可离心再过滤。

反相色谱柱的保存

1，长时间不用（一周以上），尽量保存在高比例有机相中。,

2，保存的冲洗：多数方法里会用到缓冲盐，一般先用高比例水相将缓冲盐冲洗干净，再置换成高比例有机相保存，同时也将强保留的小性污染物冲干净。

原创作者：天津谱祥伟业科技有限公司