AF647标记膜联蛋白V的【核心实验流程】大公开！AF647 Annexin V

标题：AF647标记膜联蛋白V，AF647 Annexin V

【参数信息】

英文名称：AF647 Annexin V

中文名称：AF647标记膜联蛋白V

吸收波长：655 nm

发射波长：680 nm

纯度：≥95%

储存条件：-20℃避光干燥

生产厂商：西安强化生物科技

【简单概述】

Annexin V (or Annexin A5) belongs to the phospholipid-binding Annexin family of intracellular proteins. In flow cytometry and fluorescent microscopy, Annexin V is commonly used to detect apoptotic cells by its ability to specifically bind to phosphatidylserine, which migrates from the inner to the outer leaflet of the plasma membrane during the early stages of apoptosis.

膜联蛋白 V（或膜联蛋白 A5）属于磷脂结合膜联蛋白家族的细胞内蛋白。在流式细胞术和荧光显微镜中，膜联蛋白 V 通常用于检测凋亡细胞，因为它能够与磷脂酰丝氨酸特异性结合，磷脂酰丝氨酸在细胞死亡的早期阶段从质膜的内小叶迁移到外小叶。

This Annexin V is a lyophilized conjugate with AF 647, a bright, photostable, hydrophilic far-red fluorophore with spectral characteristics similar to Cyanine5 (absorption max. at 655 nm, emission max. at 680 nm). Far-red fluorescent tags with excitation above 600 nm and emission further than 650 nm are valuable for imaging techniques because of the lower background autofluorescence at these wavelengths.

该膜联蛋白 V 是与 AF 647 的冻干偶联物，AF 647 是一种明亮、光稳定、亲水的远红外荧光团，具有与花青 5 相似的光谱特征（在 655 nm 处吸收最大，在 680 nm 处发射最大）。激发波长高于 600 nm、发射波长高于 650 nm 的远红荧光标签对于成像技术很有价值，因为这些波长的背景自发荧光较低。

【核心实验流程】

（一）细胞预处理

悬浮细胞

收集细胞至离心管，1000-2000 rpm离心5分钟，弃上清 。

用预冷的PBS洗涤细胞1-2次（离心条件同上）。

注意：洗涤需轻柔，避免机械损伤导致假阳性。

贴壁细胞

使用不含EDTA的胰酶消化（EDTA会抑制Annexin V结合）。

消化时间需优化：过短易损伤细胞，过长会降解Annexin V。

关键步骤：消化后加入含血清的培养液中和胰酶，再离心收集细胞。

用PBS洗涤细胞2次（离心条件同上）。

（二）染色体系制备

缓冲液配制

将10×或4× Annexin V结合缓冲液用去离子水稀释至1×工作液（如：1 mL 10×缓冲液 + 9 mL水）。

细胞重悬

用100-200 μL 1×结合缓冲液重悬细胞，调整密度至1-5×10⁶ cells/mL 。

（三）染色步骤

染料添加（避光操作）

加入5 μL Annexin V-AF647至100 μL细胞悬液。

加入死亡染料（二选一）：

PI（5 μL） ：常用，检测晚期凋亡/坏死。

7-AAD（5-10 μL） ：替代PI，光谱兼容性更佳。

混匀与孵育

轻柔吹吸或涡旋混匀。

室温（20-25℃）避光孵育10-30分钟（不同厂商建议时间有差异）。

孵育中可重悬细胞2-3次以提升染色均匀性。

（四）检测前处理

稀释与洗涤（根据方法选择）

一步法：直接加入400 μL 1×结合缓冲液稀释，立即上机。

两步法：先离心弃染液，再用缓冲液重悬，分辨率更高。

注意：样本需在1小时内检测，否则置于冰上避光保存。

（五）检测与分析

流式细胞仪

空白管调电压，单染管（仅Annexin V或仅PI）调补偿。

通道设置：

Annexin V-AF647：APC通道（Ex/Em ≈ 650/665 nm）。

PI：PE-Cy5或PerCP通道（Ex/Em ≈ 535/617 nm）。

荧光显微镜

Annexin V-AF647用APC滤光片，PI用Cy3/Texas Red滤光片。

【相关试剂】

ATTO 610 TCO

ATTO 620 TCO

ATTO 633 TCO

ATTO 655 TCO

ATTO 488 TCO

ATTO 680 TCO

ATTO 700 TCO

Annexin V-iFluor 633标记

Annexin V-iFluor 350标记

Annexin V-iFluor 488标记

Annexin V-iFluor 555标记

Annexin V-iFluor 594标记

Annexin V-iFluor 647标记

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本试剂仅适用于科研实验，敬请知悉。

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